碳限制条件下化能自养古菌Nitrososphaera viennensis的代谢响应机制与系统生物学解析

本综述通过热力学模型与多组学整合分析，系统揭示了氨氧化古菌（AOA）Nitrososphaera viennensis在碳限制条件下的代谢适应性策略。研究发现其通过上调3-羟基丙酸/4-羟基丁酸（3-HP/4-HB）碳固定循环、调控翻译起始因子、积累氨基酸库以及改变膜脂组成来维持细胞稳态。该研究为理解化能自养微生物在营养限制环境中的资源分配机制提供了新视角，对全球氮碳循环模型构建具有重要启示。

　　

INTRODUCTION

氨氧化古菌（Ammonia-Oxidizing Archaea, AOA）作为全球氮循环的关键驱动者，广泛分布于各种环境并常显著多于其细菌 counterparts（氨氧化细菌AOB）。尽管其对氮循环的贡献已得到广泛认知，但关于其碳代谢调控机制的认识仍十分有限。所有已表征的AOA均为自养型微生物，通过独特的3-羟基丙酸/4-羟基丁酸（3-HP/4-HB）循环固定无机碳，直接连接了全球氮循环与碳循环。该循环相较于超嗜热古菌的版本更具能效，仅需1个ATP当量且利用多功能酶催化多步反应。虽然碳固定途径已被鉴定，但其调控机制及与中心碳代谢（如TCA循环、糖异生和非氧化磷酸戊糖途径）的整合仍不明确。

RESULTS

生长与热力学模型验证

基于热力学电子当量模型（TEEM）的计算预测，Nitrososphaera viennensis每消耗1摩尔氨需同化0.064摩尔无机碳。模型显示97.2%的电子当量用于能量产生而非生物质合成。实验通过设置0-2 mM梯度碳酸氢盐浓度（以2 mM氨为恒定能源），并添加过氧化氢酶或丙酮酸作为活性氧（ROS）清除剂，验证了该阈值（0.128 mM）。低于此阈值的培养物（如0 mM碳条件E）呈现显著生长限制，其唯一碳源来自丙酮酸与H₂O₂的非酶促脱羧反应。碳平衡计算证实了碳固定效率与模型一致性（约0.1 mol C/mol N）。

蛋白质组响应揭示碳限制下的代谢重构

蛋白质组主成分分析（PCA）显示，碳充足条件（A、C、D、G）与碳限制条件（B、F、E）沿PC1轴明显分离。极端限制条件E的蛋白质组差异最大。聚类分析识别出7个蛋白表达模式集群，其中集群V（碳限制上调簇）富集了碳固定循环（15/17个关键酶）、TCA循环（琥珀酰-CoA连接酶SucD/SucC、琥珀酸脱氢酶SdhA/SdhB）、糖异生和磷酸戊糖途径相关蛋白。值得注意的是，乙酰-CoA羧化酶（碳固定关键羧化酶）在碳限制下显著上调，而柠檬酸合酶（TCA循环入口酶）下调。苹果酸脱氢酶（Mdh）虽略微下调但仍保持高丰度，提示其核心代谢地位。

P-II调控蛋白（如CnrA、CnrD、CnrC）在碳限制下上调，可能参与碳氮平衡调控。此外，一个含光合反应中心结构域的未知蛋白（NVIE_010650）对碳限制呈现高度响应，可能与核糖体成熟相关。

代谢组学揭示氨基酸积累策略

代谢物分析显示，碳限制条件E中几乎所有氨基酸的相对丰度均显著升高。糖类（葡萄糖、麦芽糖、海藻糖）仅在过氧化氢酶处理组中检测到，而蜜二糖（melibiose）特异性地在碳限制条件下积累。氨基酸的积累与蛋白质组数据中氨基酸代谢途径的上调一致，表明细胞在碳限制下优先维持氨基酸库以支持翻译准备状态。

多组学整合揭示翻译调控核心作用

蛋白质与代谢物联合相关性分析发现，甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）与15种代谢物显著相关（R ≥ 0.75）。MsrA进一步与59种蛋白呈正相关，包括翻译起始因子eIf-2a和甲硫氨酸氨肽酶（Map）。同时，肌苷-5’-单磷酸脱氢酶（GuaB，GMP合成限速酶）在碳限制下上调，而AMP合成限速酶PurA无显著变化。这些结果表明碳限制下细胞通过调控GTP合成、翻译起始因子和氨基酸可用性，优先维持翻译潜能而非活跃生长，这是一种资源分配策略。

ROS清除剂选择触发特异性应激响应

使用丙酮酸而非过氧化氢酶作为ROS清除剂时，细胞上调了烷基过氧化氢还原酶Ahp2、MsrB2和半胱氨酸合成酶CysM1，以应对细胞内ROS积累。而过氧化氢酶处理组中，细胞通过合成并外排糖类（如海藻糖）至伪周质空间缓解ROS压力。这种差异源于过氧化氢酶（大分子蛋白）无法穿透S层，而丙酮酸可自由进入伪周质直接清除ROS。

DISCUSSION

热力学模型可靠性及生态意义

本研究建立的热力学模型成功预测了AOA的碳需求（0.06 mol C/mol N），介于海洋AOA（0.1）与AOB（0.045）之间，差异源于碳固定途径效率（3-HP/4-HB vs. Calvin-Benson-Bassham循环）。模型与实验的一致性支持其应用于自然环境中AOA碳通量估算。

碳限制下的代谢策略

碳限制诱导N. viennensis从信息处理（复制、翻译延伸）转向构建块合成（氨基酸、核苷酸）。碳固定循环和TCA循环大部分酶的上调确保了碳流导向生物合成。值得注意的是，PhaB（碳固定循环中唯一使用NAD⁺而非NADPH的酶）和MmcE未响应碳限制，提示其受不同调控机制控制。苹果酸酶（YtsJ）的上调为丙酮酸生成提供了替代路径，但丙酮酸磷酸双激酶（PpdK）未检测到，支持磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PckA）作为糖异生主要入口。

翻译启动的精密调控

碳限制下，翻译起始因子（如eIf-2a）上调而核糖体蛋白下调，表明细胞降低生长速率但维持翻译准备状态。同时，MsrA通过修复氧化损伤的甲硫氨酸、GuaB通过保障GTP供应，共同支持翻译保真度。这种策略与近期宏转录组研究发现的微生物在胁迫下下调核糖体基因、上调氨基酸合成基因的模式一致。

蜜二糖作为膜稳定剂的潜在功能

碳限制下特异积累的蜜二糖可能作为古菌脂质双己糖头基（如葡萄糖-半乳糖二糖）的前体，通过增加膜紧密性降低代谢物被动扩散，减少碳损失。同时，GDGT环化酶（GrsA）的上调进一步降低膜流动性，支持这一假设。

ROS清除策略的生理基础

ROS清除剂的选择直接影响细胞内氧化应激水平。过氧化氢酶因尺寸限制无法进入伪周质，导致细胞合成糖类外排以缓解ROS；而丙酮酸可直接清除伪周质ROS，但导致细胞内ROS升高，触发Ahp2和MsrB2的上调。这种精细的应激响应机制反映了AOA对多变环境的适应能力。

古菌独特胁迫响应机制的演化意义

作为化能自养菌，N. viennensis的碳限制响应避免了能源耦合干扰，纯粹反映了碳代谢调控。其通过上调核心代谢、调控翻译启动、改变膜组成等策略，与真核生物AMPK/TOR信号或细菌严谨响应（ppGpp）均不同，体现了古菌作为独特域的功能整合特性——代谢途径类似细菌而信息机器更近真核生物。

MATERIALS AND METHODS

详细方法见补充材料，包括热力学模型构建、培养条件（42°C, pH ~7.2）、化学分析（亚硝酸盐/铵/无机碳测量）、甲醇/氯仿/水联合提取流程及数据分析流程。