日本冲绳健康牛源产志贺毒素大肠杆菌（STEC）39株完整基因组测序分析及其流行病学意义

本文推荐了一项关于日本冲绳健康牛群中志贺毒素大肠杆菌（STEC）的全基因组测序研究。研究完成了39株STEC的完整基因组组装，涵盖22种血清型，包括O157:H7等高致病型，并详细分析了其毒力因子（Stx1a、Stx2a、Stx2c等）和质粒携带情况。该研究为STEC的宿主溯源、传播机制及防控策略提供了重要数据支撑。

　　

ABSTRACT

牛被认为是产志贺毒素大肠杆菌（STEC）的主要储存宿主，STEC是一种全球范围内的重要肠道病原体。本研究提供了39株从日本冲绳县偏远岛屿健康牛中分离得到的STEC菌株的完整基因组序列。这些菌株来自一项针对牛群中STEC流行情况的队列研究。

ANNOUNCEMENT

志贺毒素（Stx）产毒大肠杆菌（STEC）是重要的食源性病原体，不仅可引起轻度腹泻，还可导致严重的出血性结肠炎和危及生命的溶血性尿毒综合征。STEC的主要毒力因子是Stx，包括Stx1和Stx2，两者又分别包含多个变体（Stx1a、Stx1c–Stx1e和Stx2a–Stx2o）。典型的STEC（如O157:H7）已获得肠细胞脱落位点（LEE）致病岛。反刍动物，尤其是牛，被认为是STEC的主要天然储存宿主。

为扩展STEC的基因组信息资源，本研究对39株从健康牛（Bos taurus）中分离的STEC菌株进行了测序。所有菌株均来自一项针对牛STEC携带情况的队列研究。

在2023年至2024年期间，从冲绳县两个偏远岛屿的64个农场共采集了230头健康牛的粪便样本。根据当地法规和机构要求，本研究涉及动物不需要伦理审查和批准。经过液体培养基培养后，使用实时荧光定量PCR（qPCR）分析培养物中的stx基因。stx阳性培养物随后涂布于大肠杆菌琼脂培养基上。经过夜培养后，通过PCR分析每个菌落的stx基因。通过该筛选流程，共获得39株STEC分离株。

使用QIAGEN Genomic-tip试剂盒按照制造商说明书纯化基因组DNA，未作任何修改。分离和DNA纯化步骤中使用的试剂和培养条件见表1。使用Rapid Sequencing Kit 96 V14（SQK-RBK114.96；Oxford Nanopore Technologies [ONT]）按照制造商方案制备测序文库，并使用MinION测序仪搭配R10.4.1流动槽（ONT）进行测序。测序后，使用Dorado v.0.8.3在超级精准（Super accurate）碱基识别模式下，配合DNA碱基识别模型dna_r10.4.1_e8.2_400bps_sup@v5.0.0生成FASTQ格式的读段数据。

每个菌株的原始ONT读段使用Hybracter流程v.0.11.0（未启用读段下采样选项）进行组装。菌株OkiPb01712和OkiPb01714无法仅凭原始读段完成基因组闭环。因此，使用NanoFilt v.2.8.0对低质量读段进行了过滤，过滤质量值（Q score）阈值分别为：OkiPb01712菌株Q>8，OkiPb01714菌株Q>20。使用ECTyper v1.0.0中的物种预测选项验证了每个菌株的物种。所有生物信息学工具均使用其默认参数运行，上述指定选项除外。

所有分离株经鉴定均为大肠杆菌，共发现22种不同的血清型，表明健康牛体内存在多种STEC，包括O157:H7等典型STEC。在牛分离株中发现的主要Stx亚型是Stx1a、Stx2a和Stx2c，这些亚型已被报道在主要STEC血清型中频繁检测到。表1同时提供了每个基因组的组装指标和登录号。染色体大小和测序覆盖度范围分别为4,831,654至5,807,644 bp（平均5,289,280 bp）和63至340×（平均169×）。所有39条染色体序列的平均G+C含量为50.7%。每个基因组包含1至11个不等的质粒。

ACKNOWLEDGMENTS

作者感谢Yuriko Sato在基因组DNA纯化方面提供的技术支持。本研究由日本厚生劳动省（MHLW）食品安全研究计划资助（项目号JPMH23KA1005），资助对象为K.N.、M.O.和Y.A.。