多聚胞嘧啶结合蛋白(PCBPs)介导的铁敏感性RNA调控新机制：连接铁稳态与转录组重塑的关键桥梁

本期推荐一项关于铁敏感性RNA调控机制的重要研究。为解决铁离子如何广泛影响基因表达调控的问题，Maria M. Aleman和Daniel Dominguez团队开展了针对多聚胞嘧啶结合蛋白(PCBP)家族的系统研究。研究发现铁螯处理引发大规模转录组变化和选择性剪接事件，证实PCBP1/2作为铁敏感剪接因子调控铁依赖性外显子选择，并首次揭示铁缺乏通过增强PCBP1-RNA结合能力调控转录组重塑。该研究为理解金属离子感知与RNA调控互作提供了新范式，对铁代谢疾病治疗具有重要启示意义。

　　

在细胞生命活动的精密调控网络中，铁离子扮演着不可或缺的角色。作为多种酶促反应的关键辅因子，铁参与DNA合成、氧化磷酸化等重要细胞过程，维持着正常的细胞功能。然而，铁平衡是一把双刃剑——过多或过少的铁都会导致细胞功能障碍甚至毒性反应。长期以来，科学家们已知细胞通过转录后机制来应对铁可用性的变化，其中铁调节蛋白(IRP) 1和2通过结合铁调节元件(IRE)来调控铁稳态相关基因的翻译。但越来越多的证据表明，铁敏感性RNA调控的范围可能远超出我们的想象。

近年来，研究人员发现了另外两种铁敏感的RNA结合蛋白(RBP)：tristetraprolin(ZFP36)在铁缺乏时上调，特异性降低电子传递链中铁依赖性蛋白的mRNA稳定性；而SRSF7剪接因子的RNA结合能力则受到铁的干扰，导致Fas/CD95等基因的选择性剪接(AS)变化。这些发现暗示着存在比先前认知更广泛的铁敏感性转录后调控网络。

在这一背景下，多聚胞嘧啶结合蛋白(PCBP)家族引起了研究人员的特别关注。这些蛋白不仅作为重要的RNA结合蛋白调控选择性剪接、翻译和RNA稳定性，还充当着关键的铁伴侣蛋白，管理细胞内铁流动。PCBP1作为首个发现的哺乳动物铁伴侣蛋白，能够将铁递送给铁蛋白(ferritin)储存，而其他PCBP家族成员(PCBP2-4)也共享这一功能。然而，细胞铁水平对PCBP指导的转录组的全局性影响尚未得到系统评估。

发表在《Nucleic Acids Research》的这项研究由Grant A. Goda和Kwame Forbes作为共同第一作者领导，深入探索了PCBPs在铁敏感性RNA调控中的核心作用。研究人员发现铁螯合剂处理引发了广泛的转录组变化，包括大量选择性剪接事件，表明存在众多感知铁的可操作转录后机制。通过比较PCBP1和PCBP2指导的选择性剪接与铁敏感性转录组，他们鉴定出了一批具有铁敏感性PCBP介导的剪接调控基因。更重要的是，铁螯合剂诱导的剪接变化在PCBPs敲低后减弱，且铁螯合或PCBP1铁结合残基突变会增强PCBP1的RNA结合能力。

研究团队运用了多种关键技术方法：使用K562细胞系进行铁螯合剂处理和基因操作，通过shRNA介导的基因敲低和四环素诱导的基因过表达系统调控PCBP1/2表达水平；采用mRNA测序分析转录组变化和选择性剪接事件；通过紫外交联免疫沉淀(easyCLIP)和甲醛交联RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)技术研究PCBP1-RNA相互作用；利用报告基因实验验证特异性剪接事件；通过蛋白质印迹分析验证铁稳态标志物表达变化。

铁螯合剂广泛改变转录组

研究人员发现，铁螯合剂21H7处理K562细胞后，引起了1899个基因显著上调和586个基因下调。这些变化不仅包括已知的铁稳态基因（如转铁蛋白受体TFRC上调和铁输出蛋白SLC40A1下调），还涉及缺氧通路、TNFα信号传导等多个信号通路。更重要的是，他们发现了近5000个显著的选择性剪接事件，其中外显子跳跃(SE)是最主要的类型。值得注意的是，铁螯合导致更多外显子被包含（2714个包含 vs 2274个跳过），这一发现首次揭示了铁可用性对RNA剪接的深远影响。

PCBP1指导的转录组改变

通过短发夹RNA(shRNA)介导的PCBP1敲低和四环素诱导的PCBP1过表达，研究人员确定了PCBP1在转录组调控中的核心作用。PCBP1敲低导致296个差异表达基因(DEG)，而过表达则引起251个DEG。特别值得注意的是，PCBP1过表达显著富集了血红素代谢通路，而下调了缺氧通路，凸显了PCBP1与铁代谢的密切联系。在选择性剪接层面，PCBP1敲低导致更多外显子被跳过（4177跳过 vs 2218包含），而过表达则促进外显子包含（1233跳过 vs 2126包含），表明PCBP1主要促进外显子包含。

铁敏感性与PCBP指导的转录组重叠

通过整合铁螯合与PCBP1敲低/过表达数据集，研究人员发现了一个显著的重叠模式。特别值得注意的是，PCBP1过表达在基因表达和选择性剪接变化方面与铁螯合处理更为相似，提示铁可用性可能减弱PCBP1介导的基因表达调控。他们在TMEM222和CARM1基因中验证了铁敏感性PCBP1依赖性剪接事件，发现铁螯合诱导的剪接变化在PCBP1敲低后减弱。报告基因实验进一步证实了PCBP1在铁敏感性剪接调控中的直接作用。

PCBP1和PCBP2的铁敏感性RNA调控

考虑到PCBP1和PCBP2的高度同源性（83%氨基酸同源性，RNA结合域达93%）和相似的铁伴侣活性，研究人员扩展了他们对PCBP2的分析。来自ENCODE联盟的数据显示，PCBP2敲低导致560个DEG，并引起显著的选择性剪接变化。更重要的是，双敲PCBP1和PCBP2实验显示，铁螯合诱导的剪接变化被完全消除，进一步支持了PCBPs在铁敏感性剪接调控中的核心作用。

低铁可用性调节PCBP1与RNA的结合

通过easyCLIP和RIP-seq技术，研究人员直接评估了铁可用性对PCBP1-RNA相互作用的影响。他们发现，虽然PCBP1的整体RNA交联率在铁螯合后没有变化，但有85个基因转录本与PCBP1的结合增加，而只有29个减少。更重要的是，他们使用了两种PCBP1变体：PCBP1△Fe（铁结合缺陷）和PCBP1△RNA（RNA结合缺陷）。研究发现，△Fe变体在对照条件下的RNA结合特征与野生型PCBP1在铁螯合条件下的特征相似，而野生型PCBP1在铁螯合条件下显示更高的RNA结合富集。这些数据支持了一个模型：铁与PCBP1的相互作用减少了其与RNA的结合。

研究结论与讨论部分强调，PCBPs作为 ubiquitous表达的RNA结合蛋白，调控众多RNA的命运，对生命活动至关重要。它们作为铁伴侣蛋白的角色使其对铁水平高度功能敏感。本研究数据表明，PCBPs通过调控选择性剪接将铁感知与转录组变化整合在一起。虽然铁结合和RNA结合活性在某种程度上是可分离的，但细胞铁水平明显影响PCBP1的RNA结合能力和功能输出。

这项研究的重要意义在于揭示了铁敏感性RNA调控的广泛性，并确定了PCBP1和PCBP2作为贡献于这一反应的关键剪接因子。铁缺乏是全球最常见的营养缺乏症，通常影响儿童和妇女。引人注目的近期研究强调了铁缺乏如何改变基因表达，特别是在母体铁缺乏的背景下。例如，铁缺乏母鼠的胚胎显示心脏祖细胞中的转录组变化与心脏畸形相关；另一项研究表明，母体铁缺乏导致的铁依赖性组蛋白去甲基酶活性损失会引起雄性新生小鼠的卵巢和乳腺发育。很可能还有其他铁敏感的发育途径尚未被描述。

除了剪接调控，PCBPs还具有额外的RNA调控功能，如对细胞和病毒mRNA的翻译控制。特别是，PCBP1作为翻译抑制子发挥作用。值得注意的是，翻译在铁缺乏期间被全局抑制。鉴于我们发现降低铁可用性增强PCBP1的RNA相互作用，PCBPs可能类似地贡献于铁缺乏期间的翻译抑制。此外，PCBPs调控涉及多种细胞过程（包括细胞因子生产和α-珠蛋白表达）的mRNA稳定性。通过PCBPs的铁敏感性mRNA稳定性调控可能影响这些相同过程。

需要指出的是，PCBP1和PCBP2调控涉及铁代谢的基因表达。虽然这些基因表达变化的一些可能被解释为由于作为铁伴侣的PCBPs损失导致铁水平改变的反应，但参与这些途径的一些mRNA在本研究中被PCBP1直接结合，也在其他研究中被鉴定出来。此外，PCBP指导的转录组涉及转录因子途径（如E2F）、发育途径、分解代谢过程和多个铁或氧相关途径（如血红素代谢和缺氧）。PCBPs因此位于基因表达和代谢的联结处。

像其他RNA结合蛋白一样，PCBPs作为核糖核蛋白复合物的组成部分执行其RNA调控功能。例如，PCBP1与U2AF2和U2 snRNP在选择性外显子的3'剪接位点相互作用，并与PABP在3'非翻译区相互作用以发挥mRNA稳定性控制。虽然有PCBP1铁敏感性蛋白质-蛋白质相互作用的证据，但完整的PCBP相互作用组，特别是与RNA相关因子的相互作用组如何响应铁仍未知。需要进一步的工作来阐明细胞铁如何调控PCBP蛋白质相互作用组。

尽管我们认为低铁水平可能驱动PCBP蛋白质-蛋白质相互作用的全局变化以 favor 增强的RNA相互作用，但铁相关和RNA相关的PCBP1或PCBP2池可能独立行动。到目前为止，与RNA结合、铁结合或两者都不结合的PCBP比例未知且可能是动态的。由于缺乏对铁与PCBP1结合的生物物理和结构工作，很难就PCBP1中的△Fe突变如何影响RNA结合得出具体结论。PCBP1在核和质中的定位及其在两个区室中铁稳态和RNA加工的已知作用进一步复杂化了理解这些活动如何交织在一起。

PCBP1 RNA结合铁敏感性的另一个可能机制可能是翻译后修饰的变化。例如，PCBP1在多个位点被磷酸化，从而被转运入或出核。一些磷酸酶的活性是铁依赖性的（如蛋白质磷酸酶1a），表明PCBP1磷酸化状态可能对细胞铁水平敏感。然而，调控PCBP1磷酸化的磷酸酶尚未被鉴定。或者，驱动PCBP磷酸化的激酶或信号通路可能在铁螯合后改变。

本研究存在几个局限性：使用铁螯合剂降低可用铁水平可能无法完全捕捉铁缺乏的影响，且脱靶效应可能有意外后果；选择16小时铁螯合持续时间可能无法捕捉早期或瞬时事件，并可能引入次级、非直接效应；使用具有已知基因组异常的癌细胞系K562可能影响转录组和代谢；使用polyA选择 during 文库制备可能 favor 具有较长polyA尾的mRNA，因此具有较短polyA尾的mRNA中铁敏感性剪接变化可能 underrepresented。

总之，PCBPs是 ubiquitously 表达的RNA结合蛋白，调控许多RNA的命运，对生命至关重要。它们作为铁伴侣的角色使它们对铁水平高度功能敏感。我们的数据表明PCBPs通过调控选择性剪接将铁感知整合到转录组变化中。需要进一步的工作来揭示可能赋予这种能力的可能多因素机制。虽然PCBPs是我们研究的焦点，但我们展示的工作可用于发现具有铁敏感性RNA调控的其他RNA结合蛋白。