前导链与滞后链无碱基位点对脊椎动物复制体进程的差异性影响及类似的旁路机制

本研究针对DNA无碱基位点(AP site)在复制过程中的处理机制这一关键问题，通过构建链特异性AP位点模板，利用非洲爪蟾卵提取物体系，揭示了前导链和滞后链AP位点虽均依赖跨损伤DNA合成(TLS)机制进行旁路，但对复制体进程产生截然不同的影响：前导链AP位点导致复制体解耦合并引发下游停滞，而滞后链AP位点仅造成滞后链合成中断。该发现为理解基因组稳定性维持提供了重要分子视角。

每天每个人类细胞中会形成约15,000个无碱基位点（AP位点），这些位点既可能自发产生，也可能由DNA糖基化酶切除受损碱基而形成。作为最常见的DNA损伤形式之一，AP位点不仅干扰DNA复制，还具有复杂的生物学效应，因为它们能够被加工成其他类型的损伤，如单链断裂(SSBs)、DNA-蛋白质交联(DPCs)和DNA链间交联(ICLs)。然而，人们对AP位点如何影响复制体（replisome）进程、引发何种修复途径，以及这些效应是否取决于受损的模板链，仍知之甚少。

为了解决这些问题，范德比尔特大学医学院的生物化学家Matthew T. Cranford、Steven N. Dahmen、David Cortez和James M. Dewar在《Nucleic Acids Research》上发表了他们的最新研究。他们利用非洲爪蟾（Xenopus）卵提取物这一强大的生化系统，开发了一种创新方法，能够分析含有位点特异性、稳定AP位点的DNA的复制过程，并分别研究其位于前导链或滞后链模板时的效应。

研究人员运用了多项关键技术：首先，他们通过分子克隆技术构建了含有特定AP位点并带有Lac阻遏蛋白（LacR）结合阵列的质粒模板，以控制复制方向并防止复制叉汇合；其次，他们利用磷酸硫酯键修饰和LacR结合来稳定AP位点，防止其在提取物中被快速修复或切割；最后，他们结合放射性标记、限制性酶切、变性凝胶电泳、测序胶分析以及免疫沉淀等技术，在高时空分辨率下详细追踪了新生DNA链的合成进程，并揭示了跨损伤DNA合成（TLS）的关键作用。

Leading and lagging strand AP sites stall DNA synthesis

（前导链和滞后链AP位点均阻碍DNA合成）

研究人员发现，无论是前导链还是滞后链上的AP位点，都能有效阻碍DNA合成，但表现出链特异性效应。复制前导链AP位点质粒时，大部分新生链的合成被延迟，最终形成的超螺旋环状单体（scCMs）比对照组晚了约15分钟。这表明AP位点干扰了子代DNA链合成的完成。对新生链的直接分析显示，AP位点处会出现一个显著的停滞中间产物，其持续存在约30分钟后才逐渐消失，伴随着全长链的延迟出现，证明合成虽被延迟但并未被永久阻断。

Leading strand AP sites rapidly stall replication of both leading and lagging strands

（前导链AP位点快速停滞前导链和滞后链的复制）

深入分析揭示，前导链模板上的AP位点会导致新生前导链在损伤前一个核苷酸的位置停滞。更重要的是，它还会导致滞后链合成在下游约100个核苷酸处停滞，停滞位置不取决于AP位点本身，而是由下游模板的其他约束（如LacR阵列）所决定。研究人员将此解释为复制体解耦合（uncoupling）——前导链聚合酶停滞导致解螺旋酶继续前进，但整个复制体最终因模板约束而停滞。当AP位点通过TLS机制被旁路后，复制体进程得以恢复。

Lagging strand AP sites stall nascent lagging but not leading nascent strands

（滞后链AP位点仅停滞新生滞后链而非前导链）

相比之下，滞后链模板上的AP位点仅停滞滞后链的合成，而对前导链的合成进程没有可检测到的影响。滞后链合成停滞于损伤位点，随后通过重新引发（repriming）在下游继续合成，产生一个复制后缺口（post-replicative gap），该缺口随后被填充。

Bypass of AP sites requires TLS

（AP位点的旁路需要跨损伤DNA合成）

研究表明，旁路AP位点严重依赖跨损伤DNA合成（TLS）机制。通过免疫沉淀去除REV1（一种关键的TLS聚合酶和支架蛋白）或聚合酶κ（Polκ），以及通过泛素乙烯砜（Ub-VS）抑制泛素信号，都有效地阻止了停滞产物的解析和全长链的形成，但对总体DNA合成没有影响。这一发现证明，无论AP位点位于哪条链，其旁路都依赖于POLκ的TLS机制。

Leading strand AP bypass supports lagging strand restart

（前导链AP旁路支持滞后链重启）

一个重要发现是，前导链AP位点的成功旁路对于停滞的滞后链重启至关重要。当TLS被抑制时，不仅前导链停滞持续，滞后链也停留在下游停滞点数小时之久，无法完成合成。这证明了前导链损伤的解决与滞后链合成的恢复之间存在功能上的耦合。

Uncoupled replisomes stall due to template constraints

（解耦合的复制体因模板约束而停滞）

通过将AP位点置于与LacR阵列不同距离的位置，研究人员发现滞后链的停滞位置是固定的（距LacR阵列约200-250核苷酸），与AP位点的具体位置无关。这表明解耦合的复制体对下游模板挑战（如蛋白质障碍或可能的拓扑压力）具有高度的敏感性，这是一个先前未被充分认识的复制体脆弱性。

研究结论与意义

该研究最终提出了一个详细的模型来解释AP位点如何影响复制叉。前导链AP位点诱导复制体解耦合和下游停滞，随后通过“即时”（on-the-fly）TLS进行旁路；而滞后链AP位点则通过“复制后”（post-replicative）TLS和缺口填充来处理。尽管对复制体进程的影响不同，但两种情况的旁路都依赖于相同的TLS机制。

这项研究的深刻意义在于：首先，它揭示了链特异性损伤对复制体功能的差异性影响，增进了对DNA复制保真性和基因组稳定性维持的理解；其次，它发现了解耦合复制体对下游模板挑战的易感性，这为了解复制应激反应和复制叉重启的调控开辟了新视角；最后，研究强调了TLS通路在处理常见内源性DNA损伤中的核心作用，为未来研究DNA损伤耐受机制的选择和调控提供了重要理论基础。这些发现对于理解癌症发生、衰老以及开发新的治疗策略都可能具有深远的影响。