不同砧木调控'纽荷尔'甜橙糖酸代谢差异的分子机制及其对果实风味品质的影响

本研究针对砧木选择如何影响柑橘果实风味品质这一关键问题，通过系统分析'纽荷尔'甜橙嫁接三种砧木（Rt、Cj、Pt）后果实发育过程中糖酸组分动态变化、关键酶活性及相关基因表达模式，揭示了Pt砧木通过提升蔗糖 synthase (SS) 活性和上调CsSS2表达显著增强后期蔗糖积累（240 DAF达48.86±2.63 mg·g?1），而Rt砧木通过维持较高 citrate synthase (CS)、isocitrate dehydrogenase (IDH) 和 isocitrate lyase (ICL) 活性及上调酸代谢基因（CsCS1、CsNADP-IDH1/2/3）表达促进有机酸保留。TOPSIS模型综合评价显示Pt砧木果实品质最优，为柑橘砧穗组合优化提供了重要分子依据。

　　

柑橘作为全球最重要的经济作物之一，中国已成为其最主要的生产国。2022年统计数据显示，中国柑橘种植面积达737万公顷，年产量超过1.08亿吨，占全球产量的34%，占世界柑橘种植面积的38%。得益于优越的亚热带气候，中国约80%的柑橘生产集中在南方热带/亚热带地区（如广西、广东、云南）。在商业品种中，'纽荷尔'甜橙（Citrus sinensis 'Newhall'）已成为华中南部地区（湖北、江西、湖南）的主要脐橙栽培品种，占地面积达200万公顷（占全国脐橙面积的65%）。

在嫁接柑橘系统中，砧木选择通过三个主要机制关键决定果实品质：（1）优化土壤水分/养分吸收效率；（2）调节激素信号通路；（3）调控接穗基因表达谱。这些砧木诱导的生理变化共同控制了果实成熟过程中糖酸积累的时间动态。当前中国柑橘生产主要使用三种砧木：柑桔（Citrus reticulata, Rt，增强矮化和早熟性）、香橙（Citrus junos, Cj，促进抗旱性）和枳壳（Poncirus trifoliata, Pt，赋予抗寒性）。风味品质作为消费者偏好的关键决定因素，主要取决于糖酸代谢的协调调控以及挥发性化合物，其中蔗糖（占可溶性总糖的50-70%）和柠檬酸（通常构成有机酸的70-90%）是主要的味觉决定因子。

尽管先前研究已经描述了砧穗组合的生理差异，但在两个关键方面仍存在显著未解决的空白：（1）砧木调控柠檬酸分解代谢（主要的酸降解途径）的分子水平机制；（2）不同砧木系统中酶活性（如蔗糖 synthase [SS]、异柠檬酸脱氢酶[IDH]）、基因表达模式（如CsSPS1、CsACL）和代谢物谱之间的时间协调。值得注意的是，现有研究主要关注静态生理测量而非动态多组学关联。嫁接砧木可以通过调节水分利用效率、养分代谢、激素信号和接穗基因表达来优化果实糖酸代谢动态，从而改善风味品质。然而，不同砧木调控'纽荷尔'甜橙糖酸代谢的精确分子机制仍不完全清楚，特别是在基因型特异性调控关键酶表达和活性方面。

本研究采用高效液相色谱（HPLC）技术测定糖酸组分，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒定量蔗糖 synthase (SS)、蔗糖磷酸 synthase (SPS)、中性 invertase (NI)、citrate synthase (CS)、isocitrate dehydrogenase (IDH) 和植物 isocitrate lyase (ICL) 的活性，并利用实时定量PCR（qRT-PCR）分析关键基因表达水平。样本来自四川雷波县脐橙果园13年树龄的'纽荷尔'甜橙，嫁接于三种砧木（Rt、Cj、Pt），在果实发育期间（开花后150、180、210和240天）系统采样，每个处理设三个生物学重复。

含量 of sugar components

分析显示砧木对'纽荷尔'脐橙果实糖积累动态有显著影响（P<0.05）。在快速膨大期（180 DAF），Rt（6.29%±0.37, FW）和Cj（6.95%±0.08）砧木果实的总糖含量显著高于Pt（4.80%±0.16）。然而，到成熟期（240 DAF），Pt果实的总糖含量显著增加至10.24%±0.16，超过Rt（9.35%±0.13）和Cj（8.61%±0.13）分别9.52%和18.93%（F=18.93, P<0.05），表现出优异的后期积累能力。

蔗糖积累在不同砧木间差异显著。Rt果实从150至240 DAF呈线性增长（平均月速率：6.12 mg·g?1），Cj果实在210 DAF达到峰值（31.71±1.36 mg·g?1）后趋于平稳，而Pt表现出加速的持续积累，成熟时达到48.86±2.63 mg·g?1，具有显著更高的平均月速率（8.23 mg·g?1, P<0.05），并从150 DAF起始终保持最高含量（240 DAF时比Rt和Cj分别高26.78%和60.72%）。

葡萄糖积累调控表现出显著的阶段特异性。Rt葡萄糖从11.93±0.90 mg·g?1（150 DAF）稳步增加至成熟时的19.20±0.71 mg·g?1，而Cj和Pt呈现双相动态——在果实快速膨大期（150-180 DAF）分别下降39.19%（至7.63±0.11 mg·g?1）和18.16%（至7.93±0.17 mg·g?1），随后在囊泡储存期（180-240 DAF）急剧增加至17.20±0.38 mg·g?1（Cj）和19.79±0.33 mg·g?1（Pt）成熟时，Pt显著高于Rt和Cj分别3.07%和15.06%（P<0.05）。

果糖积累模式与葡萄糖动态呈显著正相关（R2=0.97, p≤0.01）。Rt果糖从8.04 mg·g?1线性增加至12.64 mg·g?1（增加57.21%），而Cj和Pt显示初始抑制后恢复——Cj下降27.40%至180 DAF的5.84 mg·g?1，然后增加88.87%至11.03 mg·g?1；Pt波动最为明显，从6.69 mg·g?1下降至6.21 mg·g?1，然后上升115.62%至13.39 mg·g?1，最终显著高于Rt和Cj分别5.93%和21.40%（P<0.05）。

含量 of organic acid components

'纽荷尔'脐橙果实发育过程中糖积累的动态分析显示，不同砧木显著（P<0.05）调控可溶性糖的积累。以Cj为砧木的果实总酸含量在整个发育过程（150 DAF至240 DAF）中始终高于Rt和Pt砧木，且在所有测定时期均呈现Cj> Rt> Pt的梯度关系。三种砧木下总酸含量随果实发育逐渐下降。

在有机酸组分方面，柠檬酸在三种砧木下均呈线性下降趋势；酒石酸在Pt砧木下呈现先增加后减少的动态变化，而在Cj和Rt砧木下则持续温和下降。值得注意的是，Pt砧木在整个发育时期的柠檬酸含量在三种砧木处理中始终最低。以Cj为砧木时，柠檬酸和酒石酸含量在整个发育期间（150 DAF至240 DAF）保持最高水平，而以Pt为砧木时，两者在成熟时（240 DAF）均降至最低值，且与Cj和Rt差异显著。

苹果酸和琥珀酸含量在不同砧木间随发育时间（150-240 DAF）呈现非线性动态。苹果酸在Cj砧木下温和增加（从150 DAF的3.80±0.18 mg·g?1至240 DAF的4.97±0.04 mg·g?1），而在Rt砧木下呈"V"形曲线，先下降后反弹（150 DAF为4.86±0.09 mg·g?1，下降至210 DAF的3.78±0.20 mg·g?1，然后增加至240 DAF的4.67±0.04 mg·g?1）。Pt的苹果酸含量呈"倒V"形模式先增加后减少，210 DAF达到峰值5.63±0.05 mg·g?1。

对于琥珀酸，所有砧木处理均呈现先增加后减少的趋势，Rt砧木波动最大（150 DAF为0.38±0.06 mg·g?1，180 DAF为1.27±0.06 mg·g?1），Pt砧木波动相对较小。此外，奎尼酸含量在Pt砧木的所有处理中各测定时期均为最低。

Comprehensive evaluation of fruit quality

本实验通过TOPSIS方法量化了八个关键理化指标对三种不同砧木上生长的'纽荷尔'脐橙果实品质评价的贡献。这种客观加权方法通过SPSSAU在线平台实施，其中原始指标数据经过最小-最大标准化后，系统自动计算熵值并根据信息熵理论推导权重。糖组分的相对重要性排序为：果糖>葡萄糖>蔗糖。类似地，有机酸组分的相对重要性排序为：酒石酸>琥珀酸>奎尼酸>苹果酸>柠檬酸。总体而言，这些指标的排序为：酒石酸>果糖>葡萄糖>蔗糖>琥珀酸>奎尼酸>苹果酸>柠檬酸。这种权重分布突显了酒石酸（柑橘果实的特征酸性组分）在决定风味品质中的关键作用。

基于上述加权系统，对Pt、Rt和Cj进行了综合TOPSIS评价。结果显示，Pt的相对接近度C值为0.739（D?=0.349, D?=0.988），Rt的相对接近度C值为0.632（D?=0.491, D?=0.841），Cj的相对接近度C值为0.567（D?=0.535, D?=0.702）成熟期。因此，成熟期（240 DAF）的综合评价排名为：Pt>Rt>Cj。

Activities of sugar metabolism-related enzymes

蔗糖 synthase (SS-合成) 活性在不同砧木间表现一致的发育模式：初始下降后逐渐增加并稳定。观察到显著的砧木特异性调控（P<0.05），Pt始终保持最高活性。Pt在150 DAF达到峰值活性（245.49 U·L?1），比Cj和Rt分别高18.29%和43.79%，建立了Pt>Cj>Rt的层级。

蔗糖磷酸 synthase (SPS) 活性显示双峰进展，所有处理在180 DAF达到峰值。砧木显著影响SPS活性水平（P<0.05），Rt表现优异。Rt的峰值活性超过Pt 52.49%（P<0.05），超过Cj 127.37%（P<0.05）。统计分析表明，Rt和Pt之间的SPS活性差异显著（P<0.05），而与Cj的差异更为显著（P<0.05）。

不同砧木处理期间中性 invertase (NI) 活性的总体波动相对较小。具体而言，Pt砧木处理的NI活性始终低于其他处理（P<0.05），其活性曲线呈现特征性的V形（在210 DAF达到最低点）。相比之下，Cj砧木显示持续增加后稳定的模式，而Rt砧木呈现波动趋势，特征为初始下降、随后反弹和最终下降。

Activities of acid metabolism-related enzymes

CS活性在果实成熟过程中呈现双相趋势，先减少后增加，与总有机酸的总体减少呈负相关。值得注意的是，Rt砧木果实显示苹果酸和奎尼酸含量的明显波动，而Pt砧木果实仅在奎尼酸水平上显示类似的时间变化。这种同步行为表明CS活性对特定有机酸组分的砧木特异性调控。相比之下，Pt砧木果实显示的CS活性显著低于其他处理（P<0.05），可能有助于其减少的酸积累。

异柠檬酸裂解酶（ICL）和异柠檬酸脱氢酶（IDH）活性显示砧木依赖的调控模式。在Cj和Pt砧木果实中观察到中期成熟时ICL的瞬时激活。Rt砧木果实对两种酶显示复杂的三相模式（下降-上升-下降），与Pt砧木的持续IDH激活形成对比，后者与逐步的酸减少相关。酶层级显示，Rt砧木保持优于其他砧木的CS/ICL/IDH活性（P<0.05），机械性解释了其增强的酸保留能力。相反，Pt砧木的最小CS活性但升高的ICL/IDH活性说明了其减少的酸度。

Relative expression of genes involved in sugar and acid metabolism

不同砧木显著重塑了嫁接果实中的基因表达模式，表现出不同的时间和调控特征。在Pt砧木嫁接中，果实中关键基因的表达呈现明显的"阶段特异性增强"模式。具体而言，蔗糖合成相关基因CsSS2显示"上升-下降-上升"的动态模式，在240 DAF表达峰值，显著高于Rt和Cj砧木处理。

相比之下，关键蔗糖合成基因CsSPS1在发育早期（150-180 DAF）保持高转录水平，并在180 DAF达到单峰，表明显著的早期表达优势。

同时，蔗糖代谢和运输相关基因的表达受到紧密调控。酸/中性 invertase 基因CsA/N-InvA在150-180 DAF期间上调约三倍，随后在发育后期（210-240 DAF）表达下降。蔗糖转运蛋白基因CsSUC3和CsSUC4在发育后期被显著激活，CsSUC3在240 DAF达到峰值，CsSUC4在210 DAF达到峰值。关键ABA合成基因CsNCED1呈现单峰模式，在210 DAF达到峰值，并显著高于Rt和Cj砧木处理。

嫁接在Rt砧木上的'纽荷尔'脐橙显示酸代谢中八个关键基因的逐步上调，在240 DAF达到最大表达。这种时间放大与持续的有机酸积累相关，机械性解释了Rt嫁接果实相对于Cj和Pt对应物的升高酸含量。值得注意的是，尽管CsNADP-IDH1和CsNADP-IDH3在发育早期（150-210 DAF）保持相对较低的表达，它们在240 DAF的协调诱导显著影响了酸代谢调控。

相比之下，Cj嫁接标本显示减弱的表达谱，特别是在CsCS1、CsNADP-IDH2和CsNADP-IDH3转录本中明显。这些酸分解代谢相关基因的抑制表达与有限的有机酸降解相关，从而建立了Rt砧木果实优异酸保留能力的生化基础。

相反，Pt砧木果实显示双相表达动态，特征为210 DAF的短暂上调。CsNADP-IDH1在整个果实成熟过程中显示组成型激活，在150 DAF和240 DAF达到峰值。这种持续的表达模式，加上其他酸代谢基因的振荡行为，促进了增强的有机酸降解——特别是通过CsNADP-IDH1介导的途径——导致晚期成熟阶段酸含量的逐步减少。

Correlation analysis

SS和SPS促进蔗糖积累，而NI催化其水解。CsSUC3和CsSUC4表达与蔗糖含量呈显著正相关，表明在蔗糖跨膜运输和应激适应中具有互补作用。基因间调控网络分析揭示了蔗糖转运蛋白（CsSUC3、CsSUC4）与CsNCED1之间的显著关联。CsSUC4与CsNCED1之间存在特别强的正相关（R2=0.84, P<0.01），表明功能整合，其中囊泡糖储存机制可能与ABA介导的应激响应途径协同。这在运输水平的蔗糖分配与调节环境适应的激素信号之间建立了联系。

酸相关酶和有机酸的相关性分析揭示了不同的相互作用模式。酶ICL和IDH呈现强正相关（R2=0.93, P<0.01），暗示在代谢过程中的协同功能。在有机酸中，总酸和柠檬酸高度相关（R2=0.95, P<0.01），酒石酸和柠檬酸也显示高度正相关（R2=0.81, P<0.01），表明在其代谢途径中的共同调控。

进一步分析证明了酶对酸合成的特定调控作用。CS活性与琥珀酸积累负相关（R2=-0.59, P<0.05），表明抑制效应。基因表达分析也揭示了CsNADP-IDH2表达与奎尼酸之间的显著负相关（R2=-0.67, P<0.05），暗示潜在的抑制基因调控其合成或分解代谢。

本研究证明砧木基因型通过协调调控酶活性和基因表达显著调节'纽荷尔'脐橙的糖酸代谢。枳壳（Pt）砧木促进优异的后期蔗糖积累，分别超过柑桔（Rt）和香橙（Cj）26.78%和60.72%。这与持续高的蔗糖 synthase (SS) 活性和蔗糖代谢基因（CsSS2、CsSUC3）的上调相关。相比之下，Rt砧木增强有机酸保留，特别是苹果酸和奎尼酸，支持于峰值 citrate synthase (CS)、isocitrate dehydrogenase (IDH) 和 isocitrate lyase (ICL) 活性，以及酸代谢基因（CsCS1、CsNADP-IDH1/2/3）的逐步上调。Pt嫁接果实由于组成型CsNADP-IDH1表达和升高的IDH/ICL活性 favoring 酸降解而显示最小酸度。通过熵分析加权的TOPSIS评价确认Pt砧木在成熟时产生最佳风味品质（Ci=0.739），其次是Rt（Ci=0.632）和Cj（Ci=0.567）。这些发现为选择砧木以优化柑橘育种计划中的糖酸平衡提供了机制基础。