甘蔗及其近缘物种中5S rDNA与Cassandra逆转录元件的分化景观与进化轨迹研究

本研究针对复杂植物基因组中串联重复序列与转座元件(TEs)的进化关系这一前沿问题，以甘蔗及其近缘物种为模型，通过生物信息学与分子细胞遗传学方法，揭示了5S rDNA与5S衍生的Cassandra元件在序列结构、系统发育关系和染色体分布等方面的分化特征。研究发现虽然Cassandra元件的长末端重复(LTRs)含有高度保守的RNA聚合酶(Pol) III启动子，但通过荧光原位杂交(FISH)技术证实二者呈现完全不同的染色体分布模式，且系统发育分析表明Cassandra 5S衍生域形成独立于5S rDNA的进化分支。该研究为理解重复序列的基因组景观与进化轨迹提供了重要理论依据。

　　

在植物基因组中，重复序列一直被视为"自私DNA"或"垃圾DNA"，但随着研究的深入，人们发现这些序列对基因组结构的进化和基因功能的调控具有重要影响。其中，串联重复序列和转座元件(TEs)作为两类主要的重复序列，各自具有独特的特性和进化轨迹。5S核糖体DNA(5S rDNA)是核糖体大亚基中普遍存在的RNA组分，通常以串联排列的方式存在于特定染色体上。而Cassandra元件则是一类特殊的末端重复微型逆转录转座子(TRIM)，其长末端重复(LTRs)中含有与5S rDNA相似的序列，暗示着这两类重复序列之间可能存在进化上的联系。

然而，对于具有不同倍性水平、染色体数目、亚基因组组成和结构变异的复杂植物基因组中，5S rDNA和Cassandra元件的基因组景观和进化轨迹仍然知之甚少。甘蔗及其近缘物种作为Saccharinae亚族的成员，具有从二倍体、同源多倍体到异源多倍体的多种倍性类型，为研究这一问题提供了理想的模型系统。

为了解决这一科学问题，研究人员在《BMC Plant Biology》上发表了最新研究成果，通过对甘蔗及其近缘物种中5S rDNA和Cassandra元件进行比较分析，揭示了它们在序列、丰度、结构、组织和基因组分布等方面的特征。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：基于RepeatExplorer2的相似性聚类分析用于识别重复序列；维也纳RNAfold网络服务器用于RNA二级结构预测；邻接法(NJ)构建系统发育树；荧光原位杂交(FISH)技术用于染色体分布分析；以及利用已发布的染色体级别基因组组装进行精细拓扑分析。实验材料包括8个物种的叶片组织（用于DNA提取）和根尖（用于细胞遗传学实验），这些材料来自云南农业大学和云南省农业科学院甘蔗研究所。

5S rDNA和Cassandra元件在甘蔗及其近缘物种中的存在

通过RepeatExplorer2分析，在所有研究的物种中都鉴定出了5S rDNA和Cassandra元件的候选簇。5S rDNA在图谱中呈现简单的环状结构，而在异源四倍体E. rockii Yunnan83-224中，发现了由包含5S rDNA编码序列的连接区相互连接的两个环，表明两个亚基因组中存在不同的5S rDNA序列。Cassandra元件图拓扑结构更为复杂，特别是在两个异源四倍体物种M. sinensis Jiangxi91-8和N. porphyrocoma Guangdong64中，表明这些物种基因组中存在与Cassandra元件相关的额外序列。

Cassandra LTRs含有高度保守的5S衍生域

在所有研究的物种中，5S rDNA编码区长度高度保守，均为120 bp。Cassandra元件的长度在734到766 bp之间变化，LTRs长度在271 bp到281 bp之间。Cassandra 5S衍生域与5S rDNA序列具有相似性，尽管保守程度较低(50.80%-59.20%)，但其位于Cassandra 5S衍生域下游50到89 bp的ICR(内部控制区)表现出较高的相似性(75.60%-80.50%)。这个推定的ICR包含三个特征区域，被识别为Pol III启动子的部分：A-Box、IE(中间元件)和C-Box。

5S rRNA和Cassandra 5S衍生域RNA的独特二级结构

在所有研究的物种中，5S rRNA motifs的结构构型始终与真核生物5S rRNA的既定结构一致。Cassandra 5S衍生域RNA的结构表现出结构保守性和热力学稳定性，预测的Cassandra 5S衍生域RNA结构类似于在其他植物物种中发现的典型结构。通过比较5S rRNA和Cassandra 5S衍生域RNA的最小自由能(MFE)和 centroid结构，发现Cassandra 5S衍生域RNA在62 bp到114 bp位置具有较低位置熵的峰值，与Pol III启动子区域重合，而5S rRNA则表现出不同的峰值位置分布。

5S rDNA和Cassandra元件的差异进化动力学

FISH分析揭示了所有研究物种中特定区域上清晰而强烈的5S rDNA信号位点，这是大5S rDNA串联重复阵列的特征。在所有同源多倍体甘蔗物种和二倍体物种E. rufipilus Yunnan2009-3中，5S rDNA特异定位于chr9上，而在同源六倍体T. arundinaceum Hainan92-105中，5S rDNA位于chr5上。Cassandra元件显示出与5S rDNA不同的染色体模式，在所有染色体上观察到非常微弱且分散的FISH信号，但具有局部富集。

E. rufipilus Yunnan2009-3基因组中5S rDNA和Cassandra元件的串联排列模式

在E. rufipilus Yunnan2009-3基因组中，5S rDNA位于chr9的短臂上，而Cassandra元件分散在所有染色体上，具有局部积累。共鉴定出705个串联排列的5S rDNA拷贝和526个不同排列的Cassandra元件拷贝，包括199个完整元件、50个单独LTR和277个截短元件。在199个完整Cassandra元件中，190个包含两个LTR，5个包含三个LTR，4个元件包含四个LTR，表明在E. rufipilus Yunnan2009-3基因组中存在独特的排列模式。

研究表明，5S rDNA和Cassandra元件在甘蔗及其近缘物种中广泛存在，尽管它们的丰度相对较低。Cassandra LTRs包含一个具有高度保守的Pol III启动子的5S衍生域，表明具有强大5S域保存的模块化进化。在系统发育树中，Cassandra 5S域序列与5S rDNA完全分开，表明Cassandra的单一起源而非多次独立获得。预测的Cassandra 5S衍生域RNA折叠与5S rRNA的典型结构不同，表明它们可能存在遗传分化。FISH实验揭示了不同的染色体分布模式，5S rDNA定位到特定染色体，而Cassandra元件在所有染色体上呈现分散分布，在亚端粒或着丝粒周围区域有局部积累，强调了它们在这些物种中的差异进化动力学。最后，在二倍体E. rufipilus中观察到了5S rDNA和Cassandra元件的串联排列模式。

这项研究的意义在于提供了对甘蔗及其近缘物种中5S rDNA和5S衍生Cassandra元件的序列、丰度、结构、组织和基因组分布的全面理解。研究结果表明，在这些物种的复杂基因组背景下，5S rDNA和5S衍生Cassandra元件具有分化的基因组景观和进化轨迹，为理解重复序列在基因组进化和物种形成中的作用提供了新的视角。特别是发现尽管Cassandra元件可能起源于5S rDNA，但它们已经形成了独立的进化路径和功能特性，这一发现对理解重复序列的进化机制具有重要意义。