单细胞与空间转录组联合分析揭示透明细胞肾癌高可塑性亚群及基于机器学习的精准诊断模型

《Hereditas》：Integrated single-cell and bulk transcriptome analysis revealed high plasticity subpopulation and promising diagnosis model for clear cell renal cell carcinoma

本研究针对透明细胞肾癌(ccRCC)高度异质性及缺乏可靠生物标志物的临床难题，通过整合多组学数据，系统鉴定了具有肿瘤干细胞样特性的高可塑性亚群，并构建了包含13个基因的机器学习诊断模型。研究进一步揭示了关键基因AXL通过调控M2巨噬细胞极化促进肿瘤进展的新机制，为ccRCC的精准诊断与靶向治疗提供了新的理论依据和潜在靶点。

　　

透明细胞肾癌(ccRCC)是肾癌中最常见的亚型，约占所有肾癌病例的70-80%。尽管诊断技术和靶向治疗取得了进展，但晚期和转移性ccRCC患者的预后仍然很差，远处转移患者的5年生存率不到10%。ccRCC的一个显著特征是高度的肿瘤异质性，这给治疗带来了巨大挑战。此外，目前缺乏有效的生物标志物用于早期检测和预后监测，这严重制约了精准医疗的发展。因此，深入解析ccRCC的肿瘤异质性，并开发可靠的诊断和预后生物标志物，是当前临床亟待解决的关键问题。

为了回答这些问题，Lu等人于2025年在《Hereditas》杂志上发表了一项研究。该研究通过整合单细胞转录组测序(scRNA-seq)、空间转录组学(ST)和机器学习(ML)技术，系统性地描绘了ccRCC的细胞图谱，识别了具有高可塑性的肿瘤细胞亚群，并构建了一个高精度的临床诊断模型。研究还深入探讨了关键基因AXL在肿瘤发生发展中的功能及其与肿瘤微环境(TME)的相互作用。

关键技术方法

本研究整合了来自GEO、TCGA、ICGC和GTEx数据库的多个单细胞和批量RNA测序数据集。利用CopyKAT算法精确识别恶性肿瘤细胞，并通过cNMF、CytoTRACE 2和VIA等算法进行细胞轨迹和可塑性分析。通过多种差异表达分析算法筛选关键基因，并利用随机森林、XGBoost和LASSO回归等机器学习算法构建诊断模型。通过免疫组化(IHC)、细胞功能实验(CCK-8、克隆形成)和Transwell共培养实验对关键基因AXL进行功能验证。

研究结果

单细胞RNA测序揭示了ccRCC与癌旁正常组织的免疫微环境图谱

研究人员整合了三个包含配对样本的单细胞测序数据集，通过严格的质控和批次效应校正，构建了高质量的ccRCC单细胞图谱。分析共鉴定出13个细胞亚群，包括B细胞、髓系细胞、肥大细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和T细胞。细胞比例分析显示，肿瘤组织中T细胞比例显著增加，而上皮细胞比例显著减少。Ro/e细胞偏好性分析进一步证实，B细胞和上皮细胞在癌旁正常组织中显著富集，而T细胞、成纤维细胞和肥大细胞在肿瘤组织中显著富集。这些结果表明，在ccRCC发生发展过程中，免疫细胞被显著激活，而上皮细胞则逐渐转化为肿瘤细胞。

通过拷贝数变异分析鉴定恶性ccRCC肿瘤上皮细胞

为了精确区分恶性上皮细胞，研究人员利用CopyKAT算法对所有上皮细胞进行了拷贝数变异(CNV)分析。以癌旁正常组织的上皮细胞为参照，该分析成功识别出5443个显著多倍体细胞(恶性细胞)和437个单倍体细胞(正常细胞)。随后，研究人员对筛选出的恶性上皮肿瘤细胞进行了Leiden聚类分析，将其分为10个不同的细胞亚群，为后续的异质性研究奠定了基础。

非负矩阵分解和轨迹分析揭示了ccRCC肿瘤发生过程中的高可塑性群体

为了深入解析恶性上皮肿瘤细胞的异质性，研究人员采用了共识非负矩阵分解(cNMF)方法，将细胞分解为10个元程序(metaprogram)。PROGENy功能富集分析显示，第1和第2元程序与缺氧、JAK-STAT、MAPK、TGFb和WNT等肿瘤相关通路显著相关。为了进一步识别肿瘤异质性进化过程中的分化轨迹，研究人员应用了CytoTRACE 2算法对细胞进行评分。结果显示，cNMF 1和2元程序中的细胞具有显著升高的CytoTRACE 2相对评分，表明这些细胞处于肿瘤发生的早期阶段，具有强大的分化潜能和细胞可塑性。此外，通过VIA算法进行的伪时间分析也证实，cNMF 1和2元程序中的细胞处于伪时间的早期发育阶段。这些结果共同表明，研究人员成功鉴定了一个在ccRCC肿瘤发生早期具有强分化潜能和可塑性的肿瘤干细胞样亚群。

富集分析证实高可塑性亚群参与肿瘤恶性相关通路

为了分析这些高可塑性恶性上皮肿瘤细胞的生物学功能，研究人员将其分为高可塑性激活状态和非激活状态。CancerSEA肿瘤状态功能评分显示，高可塑性激活亚群在缺氧、血管生成、细胞分化和DNA损伤状态方面得分显著更高。Hallmark通路富集分析也表明，激活亚群显著富集于缺氧通路，而非激活细胞主要富集于氧化磷酸化通路。通过SEACells结合DESeq2伪批量分析、MAST算法和Wilcox检验，研究人员鉴定出64个在高可塑性状态中高表达的基因。GO和KEGG功能富集分析表明，这些基因主要调控上皮细胞增殖等恶性肿瘤进展相关通路。通过整合TCGA-ccRCC、GTEx和ICGC-ccRCC数据库的批量RNA测序数据，研究人员进一步筛选出21个在ccRCC肿瘤组织中特异性高表达的标记基因，这些基因主要参与Hippo信号通路等调控。

机器学习开发用于ccRCC患者诊断的可靠13基因组合

为了筛选可靠的临床诊断生物标志物，研究人员整合了来自TCGA-ccRCC、GTEx、ICGC和GEO数据库的多个配对样本的批量RNA测序数据，并应用Combat算法校正批次效应。随后，研究人员利用随机森林、XGBoost和LASSO回归三种机器学习算法，从21个候选基因中筛选关键基因。随机森林和XGBoost算法的ROC曲线下面积(AUC)分别达到0.973和0.954。通过SHAP值分析，研究人员发现CA9、CD70、NPTX2、CCDC146和ANGPTL4是模型预测中最重要的五个基因。LASSO回归分析进一步筛选出关键基因，其诊断模型的AUC值达到0.976，在三种算法中表现最佳。最终，通过三种算法的交集，研究人员确定了一个包含13个基因的标记组合，用于ccRCC的临床诊断。

关键基因AXL促进ccRCC肿瘤发生并与肿瘤免疫微环境相关

在筛选出的关键基因中，研究人员重点关注了AXL。分析显示，AXL在肾癌肿瘤组织中的表达水平显著高于正常组织或癌旁组织。在TCGA-ccRCC队列中，AXL的mRNA表达水平在肿瘤组织中显著升高，其诊断效能(AUC)为0.885。生存分析表明，AXL高表达与患者较差的总生存期(OS)、疾病特异性生存期(DSS)和无进展间期(PFI)显著相关。免疫浸润分析显示，AXL高表达组的ESTIMATE评分、免疫评分和基质评分均显著增加。进一步分析发现，AXL高表达与免疫抑制性M2巨噬细胞、中性粒细胞和CD4⁺T细胞显著正相关，而与肿瘤抑制性NK细胞和树突状细胞显著负相关。GSEA分析表明，AXL与上皮-间质转化(EMT)等肿瘤相关通路显著富集。

空间转录组学揭示了ccRCC患者中的分布模式

空间转录组学分析显示，M2巨噬细胞在肿瘤样本中呈现出明显的空间分布模式，通常围绕在恶性肿瘤细胞周围，显示出显著的空间邻近性。同时，“可塑性特征”和“Hallmark EMT特征”在肿瘤细胞密度高的区域表现出显著的空间富集。这些发现表明，M2巨噬细胞可能通过影响肿瘤可塑性和EMT过程，在支持肿瘤进展中发挥关键作用。

关键基因AXL在ccRCC中的实验验证

为了验证AXL在ccRCC发生发展中的生物学功能，研究人员进行了体外实验。PCR和免疫组化(IHC)结果显示，AXL在ccRCC肿瘤组织和细胞系中均显著高表达。通过构建AXL敲低和过表达的786-O细胞系，研究人员发现，敲低AXL显著抑制了ccRCC细胞的增殖，而过表达AXL则显著加速了细胞增殖。此外，IHC染色显示，AXL与M2巨噬细胞标记物CD206在ccRCC组织中存在空间共定位。Transwell共培养实验进一步证实，敲低AXL显著降低了ccRCC肿瘤细胞中CCL-2、CSF-1、IL-10和TGF-β等细胞因子的表达，并抑制了巨噬细胞向M2表型的分化；而过表达AXL则产生了相反的效果。这些结果表明，AXL可能通过TGF-β信号通路促进巨噬细胞向M2表型极化，从而促进ccRCC的进展。

研究结论与讨论

本研究通过整合多组学数据，系统性地描绘了ccRCC的细胞异质性图谱，并成功鉴定了一个具有高可塑性的肿瘤干细胞样亚群。该亚群在肿瘤发生早期阶段富集，并表现出与缺氧、EMT和增殖/侵袭表型相关的恶性特征。通过多种机器学习算法，研究人员构建了一个包含13个基因的可靠诊断模型，该模型在区分ccRCC与正常肾组织方面表现出优异的性能。

研究进一步将焦点集中在关键基因AXL上。AXL不仅在ccRCC肿瘤组织中高表达，而且其高表达与患者的不良预后显著相关。机制研究表明，AXL通过促进巨噬细胞向免疫抑制性的M2表型极化，重塑了肿瘤免疫微环境，从而促进了肿瘤的进展。空间转录组学分析直观地展示了AXL高表达区域与M2巨噬细胞富集区域在空间上的紧密关联，为这一机制提供了有力的证据。

综上所述，本研究不仅为ccRCC的早期诊断和预后评估提供了可靠的生物标志物和诊断模型，还揭示了AXL作为新的治疗靶点在调控肿瘤免疫微环境中的重要作用。这些发现为开发针对ccRCC的精准靶向治疗策略奠定了坚实的理论基础。