青蒿源细胞外囊泡通过重编程巨噬细胞极化与协同T淋巴细胞招募重塑乳腺癌免疫微环境

本研究针对乳腺癌免疫抑制微环境与免疫细胞浸润不足的治疗难题，探索了传统中药青蒿(Artemisia annua)源细胞外囊泡(AEVs)的免疫调控作用。研究人员通过梯度离心成功分离AEVs，发现其可有效逆转肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)从M2型向M1型极化，并通过激活NF-κB/抑制PPARγ通路促进趋化因子CCL5/CCL3分泌，进而增强CD8+/CD4+ T细胞肿瘤浸润。该研究为乳腺癌免疫治疗提供了新型植物源纳米制剂策略，发表于《Chinese Medicine》期刊。

　　

乳腺癌作为全球女性发病率最高的恶性肿瘤，其治疗面临巨大挑战。尽管现有治疗手段包括手术切除、化疗药物和放射治疗等综合方案，但肿瘤免疫微环境(TIME)的免疫抑制特性仍是治疗失败的关键因素。这种免疫抑制微环境以免疫抑制细胞和肿瘤促进性细胞因子为主，有效抑制了抗肿瘤免疫反应，促进乳腺癌的发生和发展。因此，重编程肿瘤免疫微环境以增强抗肿瘤免疫力被认为是乳腺癌临床治疗的有前景的策略，但这仍然具有高度挑战性。

肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是肿瘤微环境的重要组成部分，其极化状态与肿瘤免疫逃逸、生长和转移密切相关。M1型巨噬细胞能够产生促炎反应和抗肿瘤效应，分泌白细胞介素-6(IL-6)、IL-12和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等相关因子。相反，M2型巨噬细胞可分泌精氨酸酶-1(Arg-1)和IL-10，发挥抗炎和促肿瘤作用。因此，消耗M2型巨噬细胞或诱导M1型极化可以重编程肿瘤微环境，这已被用于癌症治疗。除了TAMs，T淋巴细胞在肿瘤适应性免疫应答中也起着关键作用。CD8⁺ T细胞是主要的细胞毒性淋巴细胞，通过直接识别和杀死肿瘤细胞来抑制肿瘤增殖。CD4⁺ T细胞也可以通过辅助CD8⁺ T细胞或在某些情况下直接识别肿瘤细胞表面抗原来发挥抗肿瘤作用。临床数据表明，乳腺癌病变中T淋巴细胞浸润水平低是一个不良预后因素。因此，通过改变巨噬细胞极化和协同T淋巴细胞招募来重编程肿瘤免疫微环境是乳腺癌的一种有前景的治疗方法。

青蒿(Artemisia annua L.)是一种常用的传统中药，自古以来就用于治疗各种疾病，包括疟疾引起的间歇热、骨蒸和虚劳发热。著名的抗疟药物青蒿素就是从这种植物中首次分离得到的。现代药理研究表明，青蒿具有免疫增强、抗肿瘤和抗炎作用，并已用于治疗乳腺癌、非小细胞肺癌、白血病、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌和肝癌。植物源细胞外囊泡(EVs)是基于脂质的小型膜结合实体，含有各种蛋白质、多糖、miRNA和其他活性物质。植物源EVs可以作为细胞外信使调节细胞间通讯。越来越多的研究证明了植物源EVs在多种癌症模型中重塑肿瘤微环境的潜力。例如，人参源EVs可以通过招募CD8⁺ T细胞进入冷肿瘤微环境来增强PD-1单抗治疗效果。口服大蒜源EVs后，γδ T细胞和IFN-γ从肠道向肿瘤微环境的转移重塑了肿瘤免疫微环境，并与抗PD-L1协同诱导抗肿瘤免疫。因此，植物源EVs构成了癌症免疫治疗的替代方法。

本研究成功通过梯度离心从新鲜青蒿中制备了细胞外囊泡(AEVs)。AEVs主要含有蛋白质、脂质、氨基酸和小分子化合物。有趣的是，青蒿素仅存在于青蒿汁源的AEVs中。单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析显示，AEVs通过将巨噬细胞极化从M2型转变为M1型，并协同增强CD8⁺和CD4⁺ T细胞在肿瘤微环境中的招募，从而抑制体内肿瘤生长。AEVs激活NF-κB信号通路同时抑制PPARγ通路，从而促进巨噬细胞的M1型极化。极化的M1型巨噬细胞分泌趋化因子(CCL5和CCL3)，促进T淋巴细胞浸润到肿瘤床。值得注意的是，AEVs在不引起全身毒性的情况下重塑了乳腺癌免疫微环境。

研究人员采用梯度离心技术从新鲜青蒿中分离细胞外囊泡，通过透射电镜(TEM)、纳米颗粒追踪分析(NTA)、Zeta电位分析、超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC-MS/MS)和高效液相色谱(HPLC)进行表征。使用单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析AEVs对体内肿瘤生长的影响机制，采用mRNA测序(mRNA-seq)进一步探索AEVs诱导巨噬细胞从M2型向M1型极化转变的机制。通过体外和体内实验评估巨噬细胞极化和T淋巴细胞向肿瘤床的招募情况。研究还涉及动物模型建立、免疫荧光分析、流式细胞术、Western blotting、实时定量PCR(qRT-PCR)和双荧光素酶报告基因检测等关键技术方法，样本来源于BALB/c小鼠和4T1/EMT-6/C127细胞系建立的肿瘤模型。

AEVs的表征和生物安全性评估

通过梯度超速离心成功从新鲜青蒿中分离出AEVs，主要富集在45%蔗糖层。透射电镜显示AEVs具有均匀的囊泡形态，流体动力学直径为137.2nm，表面电荷为-26.7mV。非靶向代谢组学分析显示AEVs主要包含有机氧化合物(20%)、苯丙素和聚酮化合物(19%)、脂质(14%)等成分。值得注意的是，青蒿素仅存在于AEVs中，而不含AEVs的青蒿汁中未检测到青蒿素。体外释放实验表明，在pH5.5条件下青蒿素的累积释放率可达82.9%。体内生物分布和生物安全性评估显示，DiD标记的AEVs在静脉注射后24小时内未在特定器官聚集，血液生化分析和组织学检查未发现显著毒性。

scRNA-seq分析AEVs抑制移植性乳腺癌生长

在EMT-6荷瘤小鼠模型中，AEVs治疗显著抑制肿瘤生长。scRNA-seq分析显示，肿瘤微环境中主要浸润细胞类型为巨噬细胞(27.8%)、中性粒细胞(24.2%)和T细胞(9.0%)。与对照组相比，AEVs显著增加T细胞和B细胞数量，减少成纤维细胞数量。巨噬细胞亚群分析表明，AEVs治疗后M1型巨噬细胞数量显著增加，M2型巨噬细胞显著减少。T细胞亚群分析显示，CD8⁺ T细胞比例从2.8%增加到11.5%，CD4⁺ T细胞比例也有所增加。

AEVs改变巨噬细胞M2型极化发挥抗肿瘤作用

研究发现AEVs可被M2型巨噬细胞优先摄取，且摄取效率随时间增加。流式细胞术分析显示，AEVs处理显著增加M2型巨噬细胞中CD80、CD86、MHC-II和TLR2/4的表达，降低CD206水平。ELISA检测表明AEVs增加IL-6和TNF-α分泌，qRT-PCR显示IL-6和TNF-α mRNA表达上调，Arg-1和IL-10下调。功能实验表明，AEVs处理的巨噬细胞上清液对MCF-7和EMT-6细胞具有剂量依赖性细胞毒性，并诱导细胞凋亡。体内实验显示，AEVs显著抑制肿瘤生长，而使用氯膦酸盐脂质体(CL)清除巨噬细胞后，抗肿瘤效果显著降低。

AEVs激活NF-κB并抑制PPARγ信号通路调节巨噬细胞极化

mRNA-seq分析发现，AEVs处理后2,343个基因显著上调，2,165个基因下调。GO分析显示差异表达基因富集于免疫应答和免疫系统调节。KEGG分析表明PPARγ信号通路被抑制，NF-κB信号通路被激活。Western blotting证实AEVs降低PPARγ和p-PPARγ水平，qRT-PCR显示PPARγ mRNA表达下降。使用PPARγ激动剂GW1929处理后，AEVs仍能抑制PPARγ表达和核转位。双荧光素酶报告基因检测发现AEVs降低PPARγ启动子转录活性，STAT6结合位点突变实验表明STAT6-Mut3位点在AEVs介导的PPARγ转录调控中起关键作用。同时，AEVs以时间依赖性方式增加P65磷酸化水平，使用IKKβ抑制剂IMD-0354处理后，AEVs仍能激活NF-κB通路。

AEVs通过诱导巨噬细胞极化促进T细胞浸润

在4T1冷肿瘤模型中，AEVs治疗显著抑制肿瘤生长。多色流式细胞术分析显示，AEVs组CD8⁺ T细胞(CD8a⁺/CD3⁺)比例从29.3%增加到35.7%，CD4⁺ T细胞(CD4⁺/CD3⁺)比例从29.9%增加到40.8%。体内趋化实验证实AEVs招募更多CD8⁺ T细胞到肿瘤组织。机制研究表明，AEVs处理后的巨噬细胞分泌趋化因子CCL5和CCL3，通过结合CCR5受体促进T细胞浸润。使用中和抗体(αCCL5和αCCL3)抑制CCL5和CCL3后，CD8⁺ T细胞迁移数量显著减少，体内抗肿瘤效果也明显降低。

本研究成功从新鲜青蒿中分离出AEVs，并证实其可通过改变巨噬细胞极化和协同T淋巴细胞招募重编程乳腺癌免疫微环境。AEVs激活NF-κB信号通路同时抑制PPARγ通路，促进巨噬细胞从M2型向M1型极化。极化的M1型巨噬细胞分泌趋化因子CCL5和CCL3，促进T淋巴细胞浸润，从而逆转免疫抑制微环境，发挥抗肿瘤作用。该研究首次揭示了青蒿源细胞外囊泡的免疫调节作用，为乳腺癌免疫治疗提供了新的植物源纳米制剂策略，突出了青蒿在癌症治疗中的药用价值。

研究的重要意义在于：一是发现了传统中药青蒿的新活性成分形式——细胞外囊泡，拓展了中药现代化研究的思路；二是揭示了植物源囊泡通过调控免疫微环境发挥抗肿瘤作用的新机制，为肿瘤免疫治疗提供了新策略；三是证实了AEVs具有良好的生物安全性，为其临床转化奠定了基础。该研究不仅为乳腺癌治疗提供了新的候选药物，也为其他植物源细胞外囊泡的研究提供了重要参考，推动了中药活性成分研究从小分子向纳米囊泡载体的范式转变。