基于Tau种子扩增技术筛选阿尔茨海默病Tau聚集抑制剂的新策略

为解决阿尔茨海默病（AD）中Tau蛋白病理性聚集和传播的难题，研究人员开发了Tau种子扩增 assay（Tau-SAA），成功实现AD脑源Tau种子的超高灵敏度检测（稀释10-8仍可检出），并筛选了220种化合物，发现57%的已知聚集抑制剂和3%的CNS穿透化合物可抑制75%以上Tau聚集，为靶向Tau的治疗策略提供了高效筛选平台。

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）是一种以进行性认知衰退为特征的神经退行性疾病，其两大核心病理标志是细胞外淀粉样蛋白-β（Aβ）斑块和细胞内Tau蛋白组成的神经原纤维缠结。近年来，靶向Aβ的疗法虽获FDA批准，但临床效益争议巨大，如Aducanumab因疗效有限退市，Lecanemab和Donanemab亦面临安全性及有效性质疑。越来越多的证据表明，Tau病理与认知损伤程度密切相关，且Tau蛋白通过“朊病毒样”机制在大脑中传播，推动疾病进展。因此，开发针对Tau聚集和传播的抑制剂成为治疗AD的新希望。

然而，传统Tau聚集检测多依赖自发形成的重组Tau原纤维，其结构与AD脑源纤维存在显著差异，限制了抑制剂筛选的生理相关性。为解决这一问题，Gorski等人在《Alzheimer's Research & Therapy》发表了研究，基于种子扩增 assay（Seed Amplification Assay, SAA）技术，建立了以AD脑源Tau种子为模板的高灵敏度检测平台，并用于大规模抑制剂筛选。

本研究主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   表达纯化六种人中枢神经系统Tau异构体，筛选出0N3R为最优SAA底物；
2. 2.
   使用26例AD及对照尸检前额叶皮层（BA46）样本验证Tau-SAA特异性；
3. 3.
   通过蛋白酶抗性实验、表位图谱和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析扩增纤维的核心结构；
4. 4.
   筛选220种化合物（包括21种疑似聚集抑制剂和201种FDA批准的CNS穿透化合物），以ThT荧光监测聚集动力学；
5. 5.
   沉降实验和透射电镜（TEM）验证抑制剂效果。

Tau-SAA设计优化与验证

研究人员首先比较了六种Tau异构体作为SAA底物的效率，发现0N3R异构体（无N端域）的扩增灵敏度最高，可检测稀释至10^-9的AD脑匀浆种子，且信号噪声比最佳。使用26例样本（11AD+15对照）验证显示，AD样本在10^-5稀释时91%为阳性，而对照组仅1例阳性，证明 assay对AD高度特异。此外，α-突触核蛋白（α-synuclein）原纤维及帕金森病（PD）、多系统萎缩（MSA）脑样本均未引发交叉反应，凸显其特异性。

SAA扩增纤维保留AD脑源Tau核心结构

蛋白酶消化和免疫印迹分析表明，SAA扩增纤维与脑源Tau均产生抗性片段（6-14 kDa）。表位图谱显示，抗R3/R4抗体（如C4、77G7）可识别消化后核心，而N端（HT7、Tau5）和C端抗体（A16097D、Tau46）则否。LC-MS/MS进一步证实核心区域为残基I₂₆₀-R₄₀₆，与AD脑源纤维核心完全一致，且最丰富肽段（IGSLDNITHVPGGNK，359-369）也与既往报道吻合。

Tau-SAA成功筛选出高效聚集抑制剂

化合物筛选以100 μM浓度进行，通过计算曲线下面积（AUC）评估抑制效果。21种疑似抑制剂中，57%（12种）抑制超过75%聚集活性，其中Azure A、Thionin、Congo Red等近乎完全抑制。201种CNS穿透化合物中，仅3%（7种）抑制＞75%，包括Tolcapone、(+)-Catechin、Topotecan、Honokiol、Sunitinib、Rifampin和Epirubicin。剂量反应分析显示亚甲蓝（Methylene Blue）抑制最强（IC₅₀=0.3 μM）。

抑制剂验证揭示复杂作用机制

二次验证选取Indomethacin（弱抑制）、Rifampin（强抑制）和Sunitinib（强抑制但TEM显示假阳性）。沉降和TEM证实Rifampin完全阻止纤维形成，而Sunitinib虽抑制ThT信号，却仍产生不溶纤维，提示其可能干扰ThT结合而非真正抑制聚集。

结论与意义

本研究开发的Tau-SAA不仅能超灵敏检测AD脑源Tau种子，还可扩增出与原生纤维结构一致的聚合体，为基于疾病相关构象的抑制剂筛选提供了可靠平台。筛选发现多种强效化合物（如Rifampin、Epirubicin），其中部分已获FDA批准，具快速临床转化潜力。此外，研究强调抑制剂验证的必要性，避免ThT干扰导致的假阳性。总体而言，Tau-SAA有望推动Tau靶向治疗的发展，尤其是针对病理传播这一AD核心机制。