综述：单细胞测序技术在肾癌中的应用：对肿瘤生物学和临床应用的见解

这篇综述系统阐述了单细胞测序（SCS）技术在肾癌研究中的突破性应用。文章详细探讨了SCS如何揭示肾癌（特别是透明细胞肾细胞癌ccRCC）的肿瘤异质性、肿瘤微环境（TME）复杂性、代谢重编程及免疫逃逸机制。通过整合空间组学和多组学数据，该技术为发现新型生物标志物、治疗靶点及个性化治疗策略提供了深刻见解，显著推动了肾癌生物学研究和临床干预的进步。

单细胞测序技术革新肾癌研究

肾癌，特别是透明细胞肾细胞癌（ccRCC），以其显著的瘤内异质性为特征，这给诊断和治疗带来了巨大挑战。单细胞测序（SCS）技术提供了前所未有的能力，能够在单细胞分辨率下详细描绘肾癌的细胞图谱，从而深入解析肿瘤异质性。

技术原理与进展

单细胞测序技术包含一系列方法学步骤：从异质性组织样本中分离单个细胞，对每个细胞进行条形码标记以追踪其来源，通过扩增将RNA转化为互补DNA（cDNA）以构建文库，随后进行测序和严格的数据分析阶段，包括降噪、去重复和细胞类型分离。该过程的最终结果是数据可视化，提供细胞基因表达、功能状态和异质性的详细图谱。

自2001年开创以来，SCS技术经历了显著进化。测序平台的创新和计算算法的开发推动了其广泛应用。特别是2009年首次实现哺乳动物细胞转录组测序，以及2011年首个人类单个细胞基因组测序研究，成为技术发展的关键里程碑。近年来，技术进步使得SCS能够更有效地解决数据处理复杂性、高成本和测序准确性等挑战。微流控平台或无微流控方法等新技术保护细胞免受剪切应力，提高细胞活力和测序质量。

技术进步不仅限于基因表达分析，还扩展到表观遗传特征的研究。单细胞染色质可及性（scATAC-seq）等技术现在常被使用，使得在单个细胞细节分辨率上检查组蛋白修饰和转录因子（TF）与DNA的相互作用成为可能。此外，单细胞代谢组学（scMetabolomics）和单细胞蛋白质组学（scProteomics）技术能够研究大量细胞群体中每个细胞的代谢途径和产物，以及检测蛋白质，从而全面了解健康和疾病中的蛋白质表达变化。

SCS与空间组学技术的整合巧妙地解决了其缺乏空间背景的限制，提供了对其空间框架内细胞异质性的全面视图。空间转录组学（ST）技术通过高分辨率成像和分析，能够揭示细胞间和组织内的分子动力学，允许精确分析细胞转录谱，并量化及可视化肿瘤微环境（TME）的异质性。

探索肾癌上皮细胞起源

通过单细胞转录组分析，最近的研究揭示了ccRCC可能起源于肾脏内的近端小管（PT）细胞。ccRCC细胞与PT细胞之间的转录组相似性提示了潜在的谱系关系。空间RNA测序技术进一步证明ccRCC的肿瘤区域富含PT细胞。分析细胞间通讯发现，ccRCC中PT细胞的一个亚群在与内皮升直小血管细胞、血管平滑肌细胞（vSMCs）、其他PT细胞和闰细胞（ICs）的信号相互作用中扮演核心角色。

对于乳头状肾细胞癌（pRCC），scRNA-seq分析显示pRCC中的PT细胞表现出与人类肾脏祖细胞相似的特征，支持pRCC细胞可能起源于这些祖细胞的观点。虽然大多数证据指向PT作为pRCC细胞的来源，但通过使用scATAC-seq也观察到pRCC细胞起源的异质性。

对于嫌色肾细胞癌（chrRCC），Decoder-seq分析显示chrRCC的肿瘤区域富含远端小管上皮细胞。scRNA-seq分析表明chrRCC与闰细胞（ICs）表现出最高相似性，提示其起源于远端肾单位。

在肾母细胞瘤（Wilms tumor）中，scRNA-seq数据分析揭示了这些恶性细胞（MCs）与其正常胎儿对应物（如输尿管芽和肾源性小泡细胞）之间的相似性。Wilms肿瘤细胞群的存在反映了这些胎儿细胞类型，提示了从健康胎儿细胞进化而来的谱系。

解析肾癌发生发展机制

单细胞测序技术揭示了肾癌上皮间质转化（EMT）和转移动态。scRNA-seq分析在各种癌症（包括ccRCC）中识别了反映细胞间协调基因表达变化并贡献于肿瘤转录异质性的元程序（MPs）。特别是ccRCC中间质样和EMT相关MPs的存在表明EMT是ccRCC进展中的关键机制。

通过scRNA-seq、空间基因组学和非负矩阵分解（NMF），ccRCC细胞被分类为六个MPs。特别是MP3富含EMT相关基因，如转化生长因子β诱导蛋白（TGFBI）和金属硫蛋白-2A（MT2A）。具有PT特征的细胞与EMT基因高表达呈负相关。重要的是，EMT高的肿瘤细胞在肿瘤-正常组织界面和肿瘤边缘更为普遍，表明ccRCC细胞具有更侵袭和迁移的表型。

代谢重编程是肾癌的一个标志性特征，特别是在ccRCC中，它已被认为是一种代谢性疾病。整合scRNA-seq与多组学导致发现了一种独特的ccRCC变体，称为去透明细胞分化（DCCD）-ccRCC。与典型的以脂质积累为标志的ccRCC不同，DCCD-ccREX由于β-氧化减少而表现出脂质水平降低。涉及脂肪酸、氨基酸和碳水化合物代谢的基因被下调，表明该亚型中的代谢重编程。

肿瘤细胞通过多种机制逃避免疫监视，这是癌症进展的一个重要因素，肾癌也不例外，表现出免疫逃逸现象，有助于疾病进展和免疫治疗抵抗。使用scRNA-seq和scTCR-seq对ccRCC的TME进行详细研究揭示了疾病进展过程中CD8⁺ T细胞的逐步耗竭和巨噬细胞的M2极化。M2样巨噬细胞和耗竭的CD8⁺ T细胞之间存在相互作用，创建了一个导致巨噬细胞和T细胞功能在TIME内持续相互抑制的正反馈相互作用循环，可能导致ccRCC中的免疫逃逸。

+ T细胞耗竭、巨噬细胞极化及内皮细胞与髓系细胞的复杂通讯。此图基于Figuredraw.com工具创建'>

解码复杂细胞通讯网络

TME内复杂的细胞间通讯与肿瘤发展和治疗反应密切相关。幸运的是，SCS将细胞间通讯研究提升到了更高的分辨率和精确度，使研究人员能够更清晰、更全面地理解这些相互作用。

在ccRCC中，一组组织驻留巨噬细胞（TR Mac）表达白细胞介素-1β（IL-1β），诱导MCs中炎症信号响应的转录因子CEBPB的表达和激活，导致基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，并促进ccRCC中的侵袭和上皮间质转化（EMT）。MCs分泌巨噬细胞迁移抑制因子（MIF），通过受体CD44和CD74作用于TAMs，促进ccRCC进展、血管生成和免疫逃逸。调节性T细胞（Tregs）分泌淋巴毒素β（LTB），与MCs上的淋巴毒素β受体（LTBR）结合，影响肿瘤进展。LTB和LTBR的高表达与ccRCC较差的临床结果相关。

描绘肿瘤免疫微环境复杂全景

大量研究表明，在肾癌TME中，免疫细胞的比例显著超过肿瘤细胞，突显了TIME在肾癌中的关键重要性。

研究表明，CD8⁺ T细胞构成RCC TIME中的主要免疫细胞群体，平均占51%，在TIME中扮演关键角色。CD8⁺ T细胞耗竭与肿瘤进展、免疫逃逸和免疫治疗抵抗相关。对各种癌症T细胞的scRNA-seq和scTCR-seq显示，与正常组织相比，RCC中的CD8⁺ T细胞表现出更大的多样性，存在多个CD8⁺ T细胞亚群。值得注意的是，其中耗竭的CD8⁺ T细胞相对更为常见。

CD4⁺ T细胞在肾癌TME中表现出显著的异质性。在多区域基因组和单细胞转录组测序中，ccRCC揭示了不同的中央记忆T细胞和CD4⁺ Tregs，显示了它们不同的组织分布。CD4⁺ T细胞还与其他免疫细胞存在复杂的相互作用。在ICB治疗背景下，CD4⁺ T细胞状态和功能的变化与治疗反应相关，表明它们作为免疫治疗疗效预测生物标志物的潜力。

最近的研究揭示了TME中巨噬细胞的复杂表型景观，超越了经典的M1/M2二分法。不同的巨噬细胞亚群显示出免疫调节基因的不同表达。值得注意的是，ICB治疗诱导一些TAM向促炎表型转变。然而，这种转变伴随着免疫检查点和抗炎信号基因的上调，可能导致免疫适应和治疗抵抗。

自然杀伤（NK）细胞在多种癌症的肿瘤抑制和促进过程中都发挥着复杂的作用。在ccRCC中，基于CD56表达水平 historically 将NK细胞分为CD56^dim和CD56^bright群体，这种分类未能阐明在肾癌中大量NK细胞浸润却未成功消除肿瘤的现象。通过scRNA-seq，将ccRCC中的NK细胞分为三个不同的簇：NK（EGR1）、NK（GZMH）和NK（CAPG）。这些簇在ccRCC中的普遍性与正常肾组织形成鲜明对比，NK（EGR1）和NK（CAPG）亚群在ccRCC中比例异常高。

树突状细胞（DCs）在多种癌症的TIME中扮演复杂多面的角色，与其他细胞成分进行广泛相互作用，从而强调了它们在癌症进展中的重要性。对ccRCC肿瘤和相邻正常组织的scRNA-seq分析识别了不同的DCs亚群，包括CD1C⁺髓系DCs（mDCs）。此外，观察到DCs与其他免疫细胞进行复杂的信号传递，表明DCs的功能状态可能与肿瘤的免疫调节相关。

+ T细胞为主）及其与其他免疫细胞和肿瘤细胞相互作用形成的免疫生态位，共同支持RCC生长和转移。此图基于Figuredraw.com工具创建'>

详细审视肿瘤基质微环境

内皮细胞（ECs）是TME的关键组成部分，在肿瘤血管生成中扮演重要角色。在肾癌中，ECs的比例各不相同，并与肿瘤分期和患者预后相关。在肾癌背景下，TME内的ECs表现出异质性。scRNA-seq分析揭示了肾癌中不同的ECs亚群。

作为肿瘤基质的重要组成部分，成纤维细胞在癌症中复杂而关键的作用日益得到认可。此外，它在各种癌症中经常表现出异质性，并构成复杂的ECM微环境。在ccRCC中，发现成纤维细胞比相邻正常组织更为丰富。

周细胞包围微血管，在血管稳定性和功能中扮演关键角色，有助于各种癌症中的肿瘤基质微环境，并在其中表现出显著的异质性。在ccRCC中，scRNA-seq分析识别了两个不同的周细胞亚群。

肾小球膜细胞是位于肾小球内的一种特殊细胞类型，在肾小球的结构和功能中扮演关键角色，其功能障碍与各种肾脏疾病的发病和进展相关。肾小球膜细胞在肾癌基质中表现出异质性。通过scRNA-seq和空间基因组学技术，识别了不同的肾小球膜细胞亚群，包括平滑肌细胞（SMCs）、经典肾小球膜细胞（MSG）和炎症状态肾小球膜细胞（MSG.inf）。

临床转化与应用前景

单细胞测序技术已证明在肾癌诊断中具有潜力，通过识别新型生物标志物和改进分子分类。它通过阐明细胞异质性与临床结果之间的关系，促进了预后分层，并有助于预测治疗反应，特别是在免疫治疗和靶向治疗中。基于SCS的临床试验目前正在进行中，旨在将这些发现转化为肾癌治疗的个性化医学。

尽管SCS技术在肾癌研究中取得了显著进展，但在数据处理复杂性和相关高成本方面仍然存在重大挑战。未来的研究工作应优先开发更高效的计算方法和实验设计，以降低成本并提高数据分析的准确性和效率。例如，需要进一步优化单细胞多组学数据整合的算法，并改进聚类和分类算法的性能。

提高SCS技术的分辨率和灵敏度以检测稀有细胞群体和低丰度转录本或蛋白质，可以提供对TME更全面的理解。这可能 necessitated 开发新的测序平台或改进现有平台。研究癌症进展和治疗期间TME的动态变化至关重要。利用SCS的纵向研究可以跟踪不同细胞类型及其相互作用的随时间演变，这将阐明肿瘤复发和转移的机制，并在疾病各个阶段识别潜在的治疗靶点。

更详细地阐明表观遗传和转录调控网络可以发现创新的治疗方法。具体来说，研究肾癌细胞及其肿瘤微环境中转录因子与表观遗传修饰剂的相互作用，可能实现针对这些协调调控机制的靶向药物开发。

将SCS与其他临床数据（如患者人口统计学、影像数据和治疗史）整合，可以增强预后模型和治疗反应预测的预测能力。这种多模态方法可以提供患者疾病状态的更全面视图，并为更个性化的治疗决策提供信息。

在更大、更多样化的患者队列中验证已识别的生物标志物是确保其临床效用所必需的。此外，开发SCS样本收集、处理和分析的标准化协议将增强不同研究结果的可重复性和可比性。

探索SCS在实时监测治疗反应中的潜力可以实现治疗失败或抵抗的早期检测，从而允许及时调整治疗策略。这可能涉及开发非侵入性或微创方法以在治疗期间获取单细胞样本。

总之，虽然SCS在肾癌研究中取得了重大进展，但在技术开发、生物学探索和临床转化方面的持续努力对于充分发挥其在改善肾癌诊断、预后和治疗方面的潜力至关重要。