基于3D高通量药物筛选发现吡维铵帕莫酸盐和柔红霉素可作为NRAS突变黑色素瘤的潜在一线疗法

本研究针对NRAS突变黑色素瘤缺乏有效靶向治疗的临床难题，通过创新性地建立3D高通量药物筛选平台，对1300余种化合物进行筛选，发现抗蠕虫药吡维铵帕莫酸盐(PP)和化疗药柔红霉素(DH)能显著抑制NRAS突变黑色素瘤生长。研究利用多细胞3D球体、水凝胶共培养系统和斑马鱼移植瘤模型验证，证明这两种药物不仅对治疗敏感细胞有效，对MEK抑制剂耐药细胞同样具有显著抑制作用，为NRAS突变黑色素瘤患者提供了新的治疗选择。

在皮肤黑色素瘤治疗领域，BRAF突变患者近年来从靶向治疗和免疫检查点抑制剂中获益显著，但占病例25%的NRAS突变患者却面临治疗选择有限的困境。目前，这类患者主要依赖免疫检查点抑制剂(ICIs)作为一线治疗，然而有效率不足50%，而二线使用的MEK抑制剂（如曲美替尼）仅为超说明书使用，疗效有限且易产生耐药。更令人担忧的是，超过一半的NRAS突变患者会出现快速疾病进展，这主要是由于缺乏能够准确模拟肿瘤微环境(TME)的临床前模型，以及黑色素瘤细胞本身对治疗的固有抵抗。

面对这一挑战，由Cristian Angeli等研究人员在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上发表的最新研究，通过先进的3D高通量药物筛选技术，发现了两种具有显著抗黑色素瘤活性的化合物——吡维铵帕莫酸盐(Pyrvinium Pamoate, PP)和柔红霉素(Daunorubicin HCl, DH)，为NRAS突变黑色素瘤的治疗带来了新的希望。

研究人员采用了几项关键技术开展本研究：首先建立3D NRAS突变黑色素瘤球体模型进行高通量药物筛选（超过1300种化合物）；通过剂量反应曲线(DRC)分析验证候选化合物；利用多细胞3D共培养模型（包含黑色素瘤细胞、成纤维细胞和内皮细胞）模拟皮肤、肺和肝转移灶微环境；采用水凝胶嵌入培养系统增强生理相关性；最后通过斑马鱼异种移植模型进行体内药效评估。研究中使用的细胞系包括商业来源和患者来源的NRAS突变黑色素瘤细胞。

结果

高通量药物筛选和剂量反应曲线分析鉴定出NRAS突变黑色素瘤的有前景新型化合物

研究人员首先使用SKmel147 NRAS突变黑色素瘤细胞的3D球体模型，对Prestwick化合物库(1267种化合物)和内部黑色素瘤药物库(61种化合物)进行了高通量筛选。通过Calcein AM染色和最大强度投影(MIP)面积分析评估细胞活力，筛选出17种最具潜力的化合物，其中包括DNA合成与损伤靶向药物（如柔红霉素HCl）、表观遗传调节剂和凋亡诱导剂等。通过剂量反应曲线验证，发现DH和PP表现出最强的抑制活性，IC₅₀值低于200 nM。

NRAS突变黑色素瘤细胞对柔红霉素HCl和吡维铵帕莫酸盐敏感

研究人员在四种NRAS突变黑色素瘤细胞系(SKmel147、SKmel30、M160915和M161022)中验证了DH和PP的抑制效果。结果显示，这两种化合物在3D球体培养中均表现出强烈的抗增殖活性，其中PP的细胞毒性尤为显著。在非癌细胞测试中，PP显示出较好的安全性，IC₅₀值远高于在癌细胞中的值。

柔红霉素HCl和吡维铵帕莫酸盐抑制NRAS突变黑色素瘤细胞的3D增殖和活力

通过时间推移显微镜技术监测3D球体的增殖情况，发现PP和曲美替尼能显著减少所有测试细胞系的球体增殖，DH在大多数细胞系中也显示出类似的抑制效果。细胞活力实验进一步证实了这两种化合物的有效性，其中PP诱导的细胞活力降低最为明显。

吡维铵帕莫酸盐对NRAS突变黑色素瘤球体具有强细胞毒作用

通过检测半胱天冬酶3/7活性和细胞死亡情况，发现PP处理能诱导显著的凋亡和细胞死亡，而曲美替尼和DH主要表现出细胞静止作用。在患者来源的转移性黑色素瘤细胞系中，PP的细胞毒作用尤为突出。

柔红霉素HCl和吡维铵帕莫酸盐抑制患者来源黑色素瘤细胞侵袭

在胶原嵌入实验中，DH和PP能显著抑制患者来源黑色素瘤细胞系M160916的侵袭能力，但在SKmel147细胞系中效果较弱，表明其抑制作用可能具有细胞系特异性。

与曲美替尼(MEKi)的联合治疗显示叠加效应

研究人员评估了DH和PP与曲美替尼联合使用的效果。虽然零相互作用效能(ZIP)协同评分分析未显示显著的协同效应，但观察到了叠加效应，特别是在SKmel147细胞中。

先进的体外3D共培养模型显示黑色素瘤特异性效应和低毒性

通过多细胞球体(MMS)和水凝胶嵌入共培养模型，研究人员证明了DH和PP在模拟不同转移部位（皮肤/真皮、肺、肝）的微环境中仍能有效抑制黑色素瘤生长，同时对非癌细胞的毒性较低。

曲美替尼抑制剂耐药黑色素瘤细胞对柔红霉素HCl和吡维铵帕莫酸盐敏感

在曲美替尼耐药的NRAS突变(SKmel30)和野生型(WM3918)黑色素瘤细胞系中，DH和PP仍然表现出显著的抑制效果，表明它们可能作为MEK抑制剂耐药患者的潜在治疗选择。

柔红霉素HCl和吡维铵帕莫酸盐在斑马鱼异种移植黑色素瘤模型中显示强抑制效果

最后，在斑马鱼异种移植模型中，DH和PP单药治疗及联合治疗均能显著减小移植瘤面积和细胞数量，证实了它们在体内的抗肿瘤活性。

讨论与结论

本研究通过先进的3D高通量筛选平台，成功鉴定出两种具有显著抗NRAS突变黑色素瘤活性的化合物——吡维铵帕莫酸盐(PP)和柔红霉素HCl(DH)。这两种已获FDA批准的药物通过药物重定位策略，显示出作为NRAS突变黑色素瘤潜在一线治疗的巨大潜力。

研究发现，PP作为一种CK1α激动剂，可能通过促进β-连环蛋白降解和抑制AKT信号通路发挥抗肿瘤作用，诱导显著的细胞凋亡和死亡。而DH作为拓扑异构酶II抑制剂，则通过引起DNA损伤发挥抗肿瘤效应。重要的是，这两种药物不仅对治疗敏感的NRAS突变黑色素瘤细胞有效，对MEK抑制剂耐药细胞同样表现出显著抑制效果。

研究的创新之处在于使用了高度生理相关的3D模型系统，包括多细胞球体、水凝胶嵌入培养和斑马鱼异种移植模型，这些模型更好地模拟了体内肿瘤微环境的复杂性，提高了研究结果的临床预测价值。

这些发现为NRAS突变黑色素瘤患者提供了新的治疗选择，特别是对于那些对现有治疗（如免疫检查点抑制剂和MEK抑制剂）无效或耐药的患者。吡维铵帕莫酸盐由于其较强的细胞毒作用和良好的安全性特征，尤其有希望成为NRAS突变黑色素瘤的一线治疗药物。此外，这两种药物的FDA批准状态将加速其临床转化进程，为患者带来更快的治疗益处。

总之，这项研究不仅揭示了吡维铵帕莫酸盐和柔红霉素HCl作为NRAS突变黑色素瘤治疗新方案的潜力，也强调了基于3D模型的高通量筛选在发现癌症新疗法中的价值，为未来肿瘤药物开发提供了重要参考。