PSMA靶向诊疗一体化纳米平台通过磁热控释YY1 siRNA诱导铁死亡实现前列腺癌精准治疗

《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》：PSMA-targeted theranostic nanoplatform achieves spatiotemporally precise therapy and triggers ferroptosis in prostate cancer treatment

本研究针对去势抵抗性前列腺癌(CRPC)治疗耐药难题，开发了Glu-urea-Lys修饰的PSMA靶向纳米平台GUL@LsiYY1@MZ。该平台通过交替磁场(AMF)触发YY1 siRNA控释，下调SLC7A11表达，破坏谷胱甘肽代谢，同时利用Mn0.6Zn0.4Fe2O4纳米颗粒诱导铁过载，协同引发铁死亡。研究证实该策略可重塑前列腺癌细胞代谢，增强脂质过氧化，并具备T2加权MRI成像功能，为前列腺癌诊疗一体化提供新方案。

　　

前列腺癌(PCa)作为全球男性发病率最高的恶性肿瘤，其治疗面临严峻挑战。虽然根治性前列腺切除术对局部肿瘤有治愈效果，但患者合并症和晚期疾病限制了其应用。雄激素剥夺疗法(ADT)作为转移性前列腺癌的一线治疗，初期能控制肿瘤生长，但肿瘤最终会进展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)——这一致命阶段以治疗耐药、转移和生存率低为特征。这种转变由分子适应性驱动，包括转录因子Yin Yang 1(YY1)的过表达，其在ADT压力下促进肿瘤可塑性和存活。尽管CRPC管理取得进展，针对这些适应性机制的疗法仍然稀缺，凸显了对创新策略的迫切需求。

铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，以细胞膜上脂质过氧化物的毒性积累为特征，导致质膜通透性受损并最终导致细胞死亡。近年来，在阐明铁死亡在肿瘤生物学和治疗中的作用方面取得了显著进展。一方面，由癌基因或致癌信号通路介导的铁死亡逃逸有助于肿瘤发生、进展、转移和治疗耐药。相反，癌症细胞独特的代谢、活性氧(ROS)水平升高以及特定突变使其中一些细胞天生易受铁死亡影响，从而揭示了某些癌症类型的脆弱性。最近研究表明，谷氨酰胺代谢在CRPC肿瘤中持续上调，这种增强的谷氨酰胺代谢驱动了一种抗氧化程序，使肿瘤细胞能够耐受更高基础水平的ROS，从而促进恩杂鲁胺耐药前列腺癌的生长。因此，CRPC似乎特别依赖铁死亡抵抗机制在代谢和氧化应激条件下生存。因此，破坏这些防御机制将对这些癌细胞致命，而正常细胞不受影响。

YY1是一种多功能转录因子，调控约10%的人类基因，在侵袭性前列腺癌中异常过表达，并与不良预后相关。先前工作表明，YY1通过实现代谢重编程和治疗耐药来驱动CRPC进展。通过siRNA沉默YY1不仅在体外抑制肿瘤增殖和转移，而且在体内延迟皮下肿瘤生长，使其成为一个有吸引力的治疗靶点。此外，最近研究揭示，YY1通过增强抗氧化途径，如SLC7A11介导的谷胱甘肽合成和PLK1驱动的NADPH产生，广泛抑制各种癌症中的铁死亡。这种活性促进了肿瘤在代谢和治疗压力下的存活，将YY1定位为诱导难治性肿瘤铁死亡的潜在靶点。

然而，siRNA递送面临关键障碍：细胞摄取差、酶降解和内涵体逃逸效率低。脂质纳米颗粒(LNPs)因其生物相容性、高负载能力和内涵体逃逸能力而成为有前景的siRNA载体。然而，独立的LNPs缺乏对siRNA释放的时空控制，并且无法解决肿瘤异质性。磁热疗法(MHT)利用交替磁场(AMF)激活氧化铁纳米颗粒(MNPs)，通过局部热生成(42-45°C)实现触发药物释放和直接肿瘤消融，提供了一种解决方案。尽管有这些优点，传统MNPs存在磁热效率低和脱靶毒性问题，限制了其临床转化。

为克服这些挑战，研究人员设计了GUL@LsiYY1@MZ——一种温敏磁性脂质纳米杂化物，它将Mn_0.6Zn_0.4Fe₂O₄(MZ)纳米颗粒与装载YY1靶向siRNA的脂质体、靶向前列腺膜特异性抗原(PSMA)的小分子Glu-urea-Lys(GUL)结合。该平台独特地整合了四个特点：(1) 通过T₂加权对比进行MRI引导的肿瘤定位；(2) 通过Glu-urea-Lys特异性识别PSMA阳性前列腺癌细胞；(3) AMF触发温和热疗下的siRNA释放；(4) 通过抑制SLC7A11诱导铁死亡。Mn-Zn掺杂增强了MZ的磁热效率，超越先前报道。GUL有效识别PSMA，并仅被PSMA阳性PCa细胞摄取，确保了该递送平台的精确靶向，而温敏脂质体确保了siRNA保护和按需释放。通过同步基因沉默和铁依赖性脂质过氧化，GUL@LsiYY1@MZ破坏了CRPC细胞中的氧化还原稳态，为治疗耐药肿瘤提供了一种双模式治疗策略。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析恩杂鲁胺耐药前列腺癌的细胞异质性和通路活性；通过高温热分解法合成不同掺杂比例的Mn_xZn_1-xFe₂O₄纳米颗粒，并系统评价其磁热性能；采用薄膜水化法制备载siRNA和MZ的温敏脂质体，并通过碳二亚胺化学偶联GUL配体构建靶向纳米平台GUL@LsiYY1@MZ；通过体外细胞实验(CCK-8、Western blot、流式细胞术、共聚焦显微镜)评估纳米系统的靶向性、细胞毒性及铁死亡诱导效果；利用转录组学和脂质组学测序深入探究铁死亡的作用机制；最后在LNCaP荷瘤小鼠模型中通过静脉给药评估纳米系统的体内抗肿瘤疗效、生物安全性及MRI成像能力。

单细胞测序分析提示恩杂鲁胺耐药前列腺癌中活性氧水平上调

通过UMAP方法进行细胞分群后，使用标记基因对细胞群体进行注释。分析显示，恩杂鲁胺耐药前列腺癌中NKT细胞和单核细胞占主导地位，而上皮细胞和Leydig细胞在恩杂鲁胺敏感病例中更普遍。这些观察结果与先前发现一致，即YY1在恩杂鲁胺耐药前列腺癌细胞中上调，特别是在单核细胞内。近期研究表明，谷氨酰胺代谢在去势抵抗性前列腺癌(CRPC)肿瘤中持续上调，促进了一种抗氧化程序，使肿瘤细胞能够耐受恩杂鲁胺治疗诱导的高ROS环境的基础水平。在本研究中，观察到恩杂鲁胺耐药前列腺癌组中ROS通路上调。这表明恩杂鲁胺耐药前列腺癌细胞拥有独特的代谢防御机制，帮助它们适应恩杂鲁胺治疗诱导的高ROS环境。破坏这种代谢平衡通常对耐药细胞有害。因此，开发能够将siRNA递送至前列腺癌细胞并靶向YY1以诱导铁死亡的纳米材料，为治疗探索提供了一条有前景的途径。

Mn_xZn_1-xF的表征和磁热效率

代表性Mn_xZn_1-xFe₂O₄(记为Mn_xZn_1-xF)(x=0.1,0.2,0.4,0.6,0.7,0.8)的透射电子显微镜(TEM)图像显示出高单分散性。通过仔细改变锰乙酰丙酮酸盐和锌乙酰丙酮酸盐前体的初始摩尔比，制备了一系列不同掺杂水平的Mn_xZn_1-xF纳米颗粒，Mn_xZn_1-xF的形态没有明显变化。所有获得的Mn_xZn_1-xF样品均为球形，尺寸均匀，约为9.0~10.0 nm，表明是单域。样品的高分辨率TEM图像表明所制备的纳米颗粒具有高结晶度。其尖晶石立方晶体性质可通过清晰的晶格条纹图案和选区电子衍射(SAED)图案确认。X射线衍射(XRD)分析显示，所有样品在20°至70°的2θ值范围内均确认为尖晶石立方结构晶体单元，衍射峰分别归属于索引晶面(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)。此外，(311)衍射峰随着x的减小向较低角度逐渐移动，表明由于Zn²⁺离子取代Mn²⁺离子导致晶体单元膨胀。根据Scherrer方程计算，不同x含量掺杂的NPs的平均晶粒尺寸分别为9.73, 9.37, 9.77, 9.47, 9.03, 和 9.73 nm，与粒径统计结果基本一致。Mn_xZn_1-xF颗粒的磁热效能与其磁性能密切相关。在300 K下的场依赖磁化(M-H)曲线显示，不同x含量的Mn_xZn_1-xF纳米颗粒的饱和磁化强度(σ_s)值分别为21.25, 29.23, 31.82, 37.31, 34.58 和 31.93 emu/g。σ_s值呈现先增后减的趋势，在x=0.6时最大化，这被解释为尖晶石铁氧体中A-B交换和B-B交换竞争的结果。纳米颗粒几乎无矫顽力，表现出超顺磁性行为，这确保了Mn_xZn_1-xF纳米颗粒不会自发聚集，适用于生物医学应用。综合以上分析，Mn_0.6Zn_0.4Fe₂O₄(MZ)具有最高的σ_s且无明显磁滞，其磁热性能最佳。在AMF(324 Oe, 270 kHz)下监测Mn_xZn_1-xF纳米颗粒溶液(0.5 mg/mL)的温度500秒，当x小于0.6时难以达到磁热治疗所需的温度。时间依赖性温度曲线显示，温度随着x的增加而显著升高。当x=0.6时，温度达到约43.8°C(比吸收率SAR=910 W/g)，展示了其在MHT中优越的磁热性能。因此，选择Mn_0.6Zn_0.4Fe₂O₄用于后续实验探索。

GUL@LsiYY1@MZ纳米杂化物的表征和性质

为提高对前列腺癌的靶向性能并避免纳米颗粒从体内被快速清除，将MZ和siRNA封装在温敏脂质体中。此外，将靶向PSMA的小分子GUL缀合到外部，形成高效的球形纳米颗粒，命名为GUL@LsiYY1@MZ。动态光散射(DLS)分析显示其平均流体动力学直径为250 nm，多分散指数(PDI)为0.339。通过紫外-可见吸收光谱、Zeta电位和热重分析(TGA)验证了纳米杂化物的成功构建。紫外光谱在260 nm处出现明显吸收峰，表明siYY1的成功整合；GUL的引入导致在290 nm处出现GUL分子的特征吸收峰。Zeta电位值显示，MZ为4.3 mV，LsiYY1@MZ为-15.4 mV，GUL@LsiYY1@MZ为-12.2 mV，进一步证实了成功的表面功能化。TGA显示MZ重量损失极小(~2.07%)，而GUL@LsiYY1@MZ在300°C左右开始出现显著重量损失，总质量损失约69.37%，这归因于有机组分的存在。GUL@LsiYY1@MZ的磁性能评估显示其σ_s为29 emu/g，矫顽力和剩磁可忽略，凸显其超顺磁性行为。此外，GUL@LsiYY1@MZ在外加磁场下能快速聚集。GUL@LsiYY1@MZ纳米杂化物在各种生理条件下以及不同pH值下均表现出优异的稳定性。为评估GUL@LsiYY1@MZ的温度响应释放能力，将杂化物暴露于AMF。处理后，GUL@LsiYY1@MZ的纳米簇结构降解并分解成许多MZ纳米晶体，证实了温敏脂质体在高温下的结构破坏。系统的释放研究表明，在生理温度(36°C)下siRNA泄漏最小(<5%)，但在高热条件下有效载荷释放显著，在42°C时达到最高累积释放。这种由温度依赖性脂质体破坏介导的热敏行为显著提高了磁热疗期间的基因递送效率。

孵育4小时后，Cy5标记的GUL@LsiYY1@MZ纳米材料被PSMA阳性的LNCaP和C4-2细胞有效内化。然而，在PSMA阴性的PC3细胞中未观察到显著的荧光信号。流式细胞术分析显示，在LNCaP和C4-2细胞中，PSMA靶向组的平均荧光强度(MFI)比非靶向组增加了2-3倍，但在PC3细胞中没有。这表明GUL@LsiYY1@MZ纳米颗粒具有优异的PSMA靶向能力，并且只能被PSMA表达细胞识别和内化。透射电子显微镜进一步证实了这些纳米颗粒被LNCaP细胞内吞。值得注意的是，在线粒体中观察到了铁死亡，其特征是线粒体体积减小、线粒体膜密度增加以及线粒体嵴减少。细胞活力测定评估了不同处理的细胞毒性和抗肿瘤功效。结果显示，GUL@LsiYY1@MZ+AMF组、MZ+AMF组、GUL@LsiYY1@MZ组和MZ组的细胞存活率分别为11%、40%、58%和87%。这些发现表明，GUL@LsiYY1@MZ+AMF制剂比单独的MZ+AMF和GUL@LsiYY1@MZ表现出更优的抗肿瘤功效，同时在100μg/mL浓度下保持低毒性。总之，GUL@LsiYY1@MZ制剂通过结合AMF处理释放siYY1，展现出增强的抗肿瘤效果，并且纳米颗粒具有良好的生物相容性。

GUL@LsiYY1@MZ在AMF下触发前列腺癌治疗中的铁死亡

在研究的后续阶段，旨在确定GUL@LsiYY1@MZ是否能在前列腺癌治疗中诱导铁死亡。过氧键能够与亚铁离子反应，通过类Fenton反应积累大量活性氧，从而导致细胞氧化损伤。随后使用DCFH-DA评估了PCa细胞中ROS的产生。与阴性对照相比，用MZ处理的PCa细胞仅显示最小的荧光强度。相反，MZ+AMF组显示出增加的荧光强度，而在用GUL@LsiYY1@MZ+AMF处理后进一步增强。这表明AMF处理通过热敏机制促进siRNA的释放，由于GUL@LsiYY1@MZ纳米颗粒和AMF处理的联合作用，协同产生最大量的ROS。通过流式细胞术进行定性分析进一步证实了ROS的产生，GUL@LsiYY1@MZ+AMF组显示出最显著的ROS积累，表明AMF处理增强了YY1沉默在PCa细胞中相关的氧化损伤。

当细胞内ROS过度积累时，一部分会转化为脂质过氧化(LPO)，这是铁死亡的关键标志物。因此，使用C11-BODIPY评估细胞内脂质过氧化水平。在MZ和对照组中检测到最小的荧光，表明LPO产生可忽略不计。相反，MZ+AMF组显示出绿色荧光的显著增加，表明产生了中等量的LPO。值得注意的是，在AMF处理下与GUL@LsiYY1@MZ孵育后，观察到明显的荧光。这一发现阐明，GUL@LsiYY1@MZ和AMF处理的联合效应促进了大量的LPO产生，这被认为有助于其比单独AMF处理更高的细胞毒性。此外，流式细胞术结果证实了共聚焦显微镜的发现，表明在PCa细胞中GUL@LsiYY1@MZ NPs+AMF组的LPO产生最大。因此，该纳米平台有效破坏了PCa细胞中的氧化还原平衡，通过积累细胞内LPO诱导铁死亡。

使用FerroOrange评估细胞内亚铁离子水平。用MZ和GUL@LsiYY1@MZ处理导致PCa细胞中的荧光强度与对照组相比略有增加。值得注意的是，MZ+AMF和GUL@LsiYY1@MZ+AMF组表现出最显著的荧光，与流式细胞术结果一致。这一观察结果可能归因于在AMF处理下，通过热敏机制从纳米材料中增强释放亚铁离子，通过Fenton反应直接诱导铁死亡。此外，siRNA降低了细胞质中YY1蛋白的产生，限制了其进入细胞核并与靶基因启动子区域结合，从而抑制氧化应激相关基因的转录并破坏细胞氧化还原平衡。

此外，为了进一步探讨观察到的细胞活力降低是否通过铁死亡介导，用铁死亡抑制剂Fer-1和铁螯合剂DFO处理细胞以评估细胞活力的恢复。结果表明，Fer-1能够不同程度地部分恢复GUL@LsiYY1@MZ+AMF、MZ+AMF和GUL@LsiYY1@MZ组的细胞活力。DFO恢复了GUL@LsiYY1@MZ+AMF和MZ+AMF组的细胞活力。然而，MZ组的细胞活力无法被Fer-1或DFO恢复。这些发现证实了AMF触发的氧化级联反应是执行铁死亡的原因。值得注意的是，在没有AMF的情况下，GUL@LsiYY1@MZ也通过瞬时释放siYY1诱导铁死亡，其介导了SLC7A11的抑制，从而独立于铁过载而瓦解谷胱甘肽依赖性抗氧化防御。相比之下，单独的MZ导致细胞活力仅轻微降低，主要通过非氧化机制。

氧化脂质组学分析

铁死亡是一种以铁依赖性磷脂(PL)过氧化为特征的细胞死亡机制。从概念上讲，铁死亡可被视为细胞代谢的结果，其中氧气和铁作为代谢过程的基本组成部分，不可避免地导致ROS的产生。当一种特定类型的ROS，即磷脂过氧化物(PLOOH)，未能被充分中和并积累到损害质膜完整性的水平时，细胞就会发生铁死亡。为了研究这一过程，对GUL@LsiYY1@MZ+AMF组与NC组相比的氧化脂质代谢物进行了脂质组学分析。采用主成分分析(PCA)评估样本的聚集和离散程度。PCA结果表明，GUL@LsiYY1@MZ+AMF组的氧化脂质代谢物与NC组存在显著差异，具有不同的聚集模式。两组间的差异代谢物分析进一步鉴定出11种显著上调和5种显著下调的氧化脂质代谢物。研究鉴定出八种花生四烯酸(AA)、四种二十二碳六烯酸(DHA)、两种二十碳五烯酸(EPA)、一种二十碳三烯酸(MA)和一种亚油酸(LA)的存在，它们均属于多不饱和脂肪酸(PUFAs)。KEGG通路分析显示，这些化合物主要富集于代谢通路。在细胞环境中，PL过氧化的底物是sn2位含有PUFA链的磷脂。在生物活性铁存在下，含PUFA的磷脂(PUFA-PLs)可通过酶促和非酶促脂质过氧化过程转化为PLOOH。本研究中，用GUL@LsiYY1@MZ+AMF处理PCa细胞产生了大量的PUFAs，超过了细胞固有的保护机制，最终诱导铁死亡。然而，Pearson相关分析表明，一些PUFAs呈负相关，暗示GUL@LsiYY1@MZ+AMF处理诱导的代谢改变可能集中在特定通路中。高度不饱和的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱作为信号分子，特别容易被氧化，从而触发细胞铁死亡，尤其是在花生四烯酸存在的情况下。近期研究报道其他PUFAs，如DHA、EPA和LA，也能诱导细胞铁死亡。本研究表明，几种多不饱和形式的花生四烯酸(5-oxoETE, 8(9)-DiHET, 8,9-EET, 9-HETE, 和 11,12-EET)、DHA(13-HDHA, 17-HDHA, 8-HDHA, 和 11-HDHA)和EPA(TxB3)在GUL@LsiYY1@MZ+AMF处理后显著上调。总之，氧化脂质组学分析揭示，PUFAs的增加和LPO的积累与GUL@LsiYY1@MZ+AMF处理在PCa细胞中诱导的铁死亡有关。

转录组学分析

使用RNA测序和配对比较分析了各种纳米颗粒对LNCaP细胞基因表达的影响。火山图显示了GUL@LsiYY1@MZ+AMF与NC、GUL@LsiYY1@MZ+AMF与MZ+AMF、以及MZ+AMF与NC之间的差异表达基因(DEGs)。分析发现mRNA表达发生显著变化，每次比较中均有数千个基因上调和下调，表明纳米颗粒处理导致基因表达模式发生显著改变。

谷胱甘肽(GSH)和GPX4在抗氧化防御系统中起着关键作用。由于各种因素导致这种细胞内抗氧化机制受损，会引起脂质过氧化物积累，最终诱导铁死亡。KEGG通路富集分析表明，三组中的DEGs均与铁死亡通路显著相关，特别是涉及GSH代谢的通路。这表明GUL@LsiYY1@MZ与AMF