环境变异驱动南极石首鱼鳃相关微生物组功能可塑性：宏转录组视角揭示宿主-微生物互作新机制

本研究通过宏转录组学分析，探讨了巴塔哥尼亚峡湾环境波动对南极石首鱼(Lithodes santolla)鳃相关微生物组功能的影响。研究人员比较了两个不同环境地点（Ballena Sound和Choiseul Bay）的样本，发现微生物组成略有差异但以变形菌门为主，并鉴定出与能量产生、应激响应和微生物互作相关的关键代谢通路。差异表达分析揭示了碳固定、离子转运和氧化应激响应的变化，表明环境条件可调控这些生理响应。此外，宿主转录本显示免疫调节和代谢稳态通路的差异富集，提示微生物组介导了宿主生理调节。该研究首次揭示了L. santolla与环境因素间的动态关系，强调了鳃相关微生物组可塑性在适应变化生境中的重要性，为评估亚南极生态系统全生物韧性提供了新视角。

　　

在亚南极地区的海洋生态系统中，环境变异如盐度波动、低温及氧气可用性的季节性变化，对水生生物及其共生微生物群落构成了持续挑战。鳃作为水生生物与环境之间的主要界面，承载着多样且动态的微生物群落，这些微生物在宿主生理中扮演着基础角色，包括代谢调节、免疫响应和环境适应。然而，环境变异如何影响微生物基因表达及宿主-微生物互作，尤其是在亚南极区域，仍知之甚少。南极石首鱼(Lithodes santolla)作为一种底栖十足类动物，生态和经济价值显著，栖息于亚南极沿海和峡湾区域的深冷水域，暴露于广泛的非生物条件中，这可能导致微生物多样性变化，影响微生物类群的相对丰度和功能。尽管越来越多的证据表明环境变异影响海洋宿主微生物组组成，但我们对这些变化如何影响L. santolla微生物功能的理解仍然空白。

为填补这一空白，本研究采用宏转录组学方法，捕获实时基因表达谱，以识别微生物群落对环境变化的功能响应。研究人员从两个环境条件不同的地点——Ballena Sound和Choiseul Bay（相距约32公里，均位于Santa Inés Island）收集了L. santolla个体，每个地点5个样本，记录了盐度、温度、pH、溶解氧和氧饱和度等环境参数。Ballena Sound的平均盐度为24.66 PSU，温度7.63°C，溶解氧浓度9.86 mg/L，氧饱和度92.31%；Choiseul Bay的盐度较高（29.21 PSU），温度8.74°C，溶解氧浓度11.17 mg/L，氧饱和度95.36%。鳃组织被切除并保存在RNAlater溶液中，随后提取总RNA，使用rRNA去除方法制备cDNA文库，并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端测序(2x150 bp)。

关键实验技术包括：样本收集与环境参数记录（使用多参数探头）、RNA提取（TRIzol试剂）、质量评估（NanoDrop和Qubit）、rRNA去除（SortMeRNA）、de novo转录组组装（Trinity）、组装质量评估（BUSCO）、开放阅读框预测（TransDecoder）、 taxonomic和功能注释（DIAMOND against NCBI NR数据库，eggNOG-mapper用于GO、KEGG、COG和EC编号，KAAS用于KEGG通路注释）、差异表达分析（DESeq2，FDR≤0.05且log₂ fold change ≥2）、功能富集分析（GOseq和clusterProfiler）。这些方法允许研究人员全面分析宿主和微生物组的转录组动态，并识别对环境变异的功能响应。

De novo gill holo-transcriptome assembly

测序结果产生了10个cDNA文库，获得332,804,332条清洁读长。组装了三个全转录组：全局（Ballena+Choiseul）、Ballena和Choiseul。BUSCO评估显示，组装具有高度完整性，真核和节肢动物直系同源物覆盖度超过90%，原核直系同源物覆盖度超过60%。主成分分析（PCA）显示样本间存在转录组变异，PC1和PC2解释了46.78%的方差，但两个Choiseul样本与Ballena组聚类更近，表明个体间变异。差异表达分析识别出7819个差异表达基因（DEGs），其中Choiseul中7207个上调，Ballena中612个上调。

Taxonomic composition of the microbiome in the L. santolla holobiont

Ballena组装包含68,115个注释ORFs（40,408宿主；14,565微生物；13,142其他类群），Choiseul有78,513个注释ORFs（41,369宿主；26,825微生物；10,319其他类群）。微生物ORFs被分类为古菌、细菌、真菌和原生生物。在Ballena，古菌占0.2%，细菌67.0%，真菌11.0%，原生生物21.8%；Choiseul中古菌0.2%，细菌65.2%，真菌7.4%，原生生物27.2%。变形菌门是两地的主要细菌门（Ballena 43.5%，Choiseul 40.0），其次是拟杆菌门（Ballena 12.0%，Choiseul 14.5）和疣微菌门（Ballena 2.2%，Choiseul 1.8）。真菌中以微孢子虫门为主（Ballena 10.3%，Choiseul 6.6），原生生物中以纤毛虫门为主（Ballena 17.7%，Choiseul 18.5）。Bray-Curtis相异度分析显示微生物群落结构略有差异（Bray-Curtis=0.297），卡方检验表明微生物组成在条件间存在显著差异（x²=549.60, p<7.64E-97）。

Functional analysis of L. santolla holobiont

GO术语分析将基因功能分类为生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。Ballena组装注释了26,876个基因（22,303宿主衍生，2290微生物衍生），Choiseul组装注释了31,538个基因（22,711宿主衍生，4374微生物衍生）。宿主数据集在所有三个GO类别中拥有最多术语，Choiseul宿主表现最高。酶分类（EC）分析显示，转移酶是最丰富的类（40.6），其次是水解酶（28.8）、氧化还原酶（16.0）、连接酶（5.8）、异构酶（3.7）和裂合酶（5.1）。Choiseul宿主和微生物组数据集表现出比Ballena更高的蛋白质注释 repertoire。

Functional enrichment analysis of DEGs

功能富集分析识别出差异富集的GO术语和KEGG通路。在微生物水平，Ballena样本富集了与碳代谢相关的术语，如“碳固定”（GO:0015977），包括上调基因RuBisCO（fold change 3.84）和“镍离子结合”（GO:0016151），包括镍依赖氢酶大亚基（fold change 8.77）。其他富集术语包括“氧化还原酶活性”（GO:0016491）和“硫化合物结合”（GO:1901681），涉及铁氧还蛋白氧化还原酶（fold change 6.52）和一氧化碳脱氢酶（fold change 5.97）。Choiseul样本富集了“主动单原子离子跨膜转运活性”（GO:0022853）和“催化活性”（GO:0003824），包括上调基因FoF1 ATP合酶亚基α（fold change 5.28）、液泡质子-无机焦磷酸酶（fold change 6.18）和Na,H/K antiporter P-type（fold change 6.15）。

在宿主水平，Ballena样本富集了“酶抑制剂/调节剂”（GO:0004857/GO:0030234），包括上调基因crustin（fold change 2.36）和type IIa crustin（CruIIa-4）（fold change 2.00），以及“磷酸离子转运”（GO:0006817）和“单原子离子转运”（GO:0006811），涉及钠依赖磷酸转运蛋白2（fold change 2.45）和锌转运蛋白2（fold change 23.0）。Choiseul样本富集了“单原子阳离子跨膜转运”（GO:0098655）和“跨膜转运”（GO:0055085），包括上调基因铵转运蛋白Rh type A（RhAG）（fold change 3.53）和ATP合酶（fold change 5.30），以及“抗氧化活性”（GO:0016209）和“催化活性”（GO:0003824），涉及过氧化物酶（fold change 5.53）、硫氧还蛋白依赖过氧化物还原酶（fold change 6.04）、延胡索酸水合酶（fold change 7.48）和NADH-泛醌氧化还原酶（fold change 4.74）。

KEGG通路富集显示，在微生物水平，Ballena样本富集了代谢通路，如碳代谢、TCA循环、糖酵解/糖异生和氧化磷酸化，反映增强的能量生产和碳处理功能。Choiseul微生物样本富集了与蛋白质周转和细胞稳态相关的通路，如蛋白酶体、内质网中的蛋白质处理和自噬。在宿主水平，Ballena样本富集了抗原处理和呈递以及内吞作用，而Choiseul样本富集了各种信号通路、蛋白酶体、药物代谢（其他酶）、吞噬体和内吞作用。

研究结论和讨论部分强调，这是首次对L. santolla鳃相关微生物组的分类组成和功能动态进行表征。宏转录组分析揭示了微生物群落结构和功能活动的差异，表明环境变异影响微生物动态。多变量分析显示组间分离，但也观察到个体间变异，可能归因于个体生理响应或遗传背景差异。功能谱在不同地点间表现出明显变化，突出了当地环境条件对微生物分布、丰度和功能的影响。尽管存在当前限制，这些发现为了解L. santolla全生物转录组动态提供了宝贵的第一步，并为未来在更广泛空间和时间尺度的研究奠定了基础。

鳃相关微生物群落对环境变化表现出动态响应，反映微生物组成随非生物条件变化的转变。在L. santolla中，鳃微生物组表现出组成变化，可能受当地环境条件影响。类似模式在其他甲壳类动物的鳃微生物组中观察到，突出了环境因素对微生物功能的影响。尽管微生物组成存在轻微的站点特异性差异，变形菌门在两个地点都是主要微生物门，与先前的河口和海洋甲壳类鳃研究一致，表明在全生物功能中跨环境条件的保守作用。

富集分析突出了与对环境条件的生理响应相关的代谢和免疫相关通路。在微生物水平，Ballena样本富集了与碳代谢、TCA循环和其他碳固定通路相关的通路，表明该环境中的微生物群落依赖有氧呼吸和碳循环维持能量生产。Ballena微生物组还显示了自养/化学合成功能的富集，特别是碳固定和金属结合功能（如RuBisCO、镍依赖氢酶大亚基），以及氧化还原相关活动，表明微生物参与CO₂固定和硫化合物代谢解毒。这些功能可能支持在波动条件下的解毒和能量保存策略。

与此同时，Choiseul微生物群落揭示了运输相关活动的富集，表明离子平衡和溶质通量的主动调节（如Na,H/K antiporter P-type、液泡质子-无机焦磷酸酶、FoF1 ATP合酶亚基α）。此外，ABC型转运蛋白功能突出，通常与相容溶质摄取和离子输出相关，这可能反映微生物对环境盐度波动的响应。

在宿主水平，Ballena样本显示了内吞作用和抗原处理与呈递的富集，表明潜在代谢转变和免疫激活以响应环境条件。免疫调节相关基因（如crustin、type IIa crustin）的富集与甲壳类中常见的抗菌防御机制一致。溶质和离子运输相关基因的富集（如钠依赖磷酸转运蛋白2、锌转运蛋白2）可能有助于在环境压力下维持离子和渗透平衡。

在Choiseul，宿主显示了信号通路如Rap1和mTOR的富集。mTOR通路的激活可能反映涉及免疫响应和代谢调整以应对环境波动的调控机制。GO术语的富集还指向离子调节和能量代谢，涉及跨膜运输和氮排泄的上调基因（如Rh type A铵转运蛋白、ATP合酶）。这些可能反映Choiseul环境中增加的渗透调节需求。抗氧化机制也很明显，以氧化还原平衡酶的表达为标志（如过氧化物酶、硫氧还蛋白依赖过氧化物还原酶、延胡索酸水合酶、NADH-泛醌氧化还原酶）。

总体而言，Ballena和Choiseul之间宿主和微生物通路富集的观察到的差异表明，环境条件影响L. santolla全生物内的 distinct功能响应。虽然两个地点的宿主通过不同分子通路调节运输和应激相关过程，但它们相关的微生物群落表现出代谢和调控谱。这些发现强调了鳃相关微生物组的功能可塑性，并提供了对宿主转录响应波动海洋环境的见解。随着全球气候变化和人为干扰继续塑造南部海洋系统，了解宿主-微生物互作如何响应非生物变异对于预测物种韧性至关重要。未来研究应扩大采样到更多地点和季节，增加生物重复，并整合多组学方法与环境监测，这将进一步阐明L. santolla中微生物转录组响应和宿主-微生物互作的机制。这些努力对于解清上下文依赖的微生物功能和更好表征亚南极甲壳类中微生物群落的生态角色至关重要。