超越拟南芥种皮颜色：黄酮类化合物表征的新视角与多物种应用

《Planta》：Flavonoid characterization: It takes more than Arabidopsis seed colours!

本刊推荐：为解决传统黄酮类化合物研究过度依赖拟南芥种皮颜色表型的问题，研究人员系统开展了种子黄酮代谢组学表征研究。通过LC-MS技术揭示了拟南芥种子中17种黄酮醇和原花青素寡聚体的多样性，发现TT10基因编码漆酶样氧化酶参与氧化聚合过程。该研究建立了黄酮分析新方法，为多物种应用提供了重要技术支撑。

　　

在植物生物学研究的历史长河中，黄酮类化合物始终扮演着特殊角色。从孟德尔利用豌豆花色发现遗传定律，到麦克林托克通过玉米籽粒颜色变异发现转座子，再到纳波利基于矮牵牛花色变异揭示共抑制现象，这些里程碑式的发现都得益于对植物颜色的观察。然而，当研究深入到分子层面时，科学家们发现单纯依靠颜色表型已无法满足现代生物学研究的需求。

拟南芥作为模式植物，其透明种皮（transparent testa，tt）突变体为黄酮代谢研究提供了宝贵材料。这些突变体因种皮颜色变化而被发现，包括从棕色野生型到黄色或紫色种子的多种变异。但早期研究主要依赖薄层色谱（TLC）和光谱分析，只能检测少数花青素和黄酮醇衍生物，严重限制了对黄酮代谢通路的深入理解。

代谢组学技术的革命性进展为这一领域带来了转机。液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术成为黄酮类化合物分析的黄金标准，使研究人员能够精确鉴定和定量每个代谢物。在这一背景下，Jean-Marc Routaboul团队开展了系统性研究，旨在全面揭示拟南芥种子黄酮类化合物的组成特征。

关键技术方法

研究采用LC-MS技术对拟南芥种子黄酮类化合物进行系统分析，结合酸性水解比色法检测原花青素（PAs）。通过对11个tt突变体的代谢谱分析，利用数量性状位点（QTL）定位解析自然变异，并将拟南芥中的发现应用于油菜和亚麻荠等油料作物。

黄酮类化合物的多样性

植物界中存在超过9,000种黄酮类化合物，它们都具有C₆-C₃-C₆的基本骨架结构。根据连接链的氧化程度和饱和度不同，可分为花青素、黄酮醇、黄烷酮等多个类别。拟南芥种子中主要含有黄酮醇和原花青素两大类，但具体组成长期以来知之甚少。

通过精细的LC-MS分析，研究团队在拟南芥种子中鉴定出17种不同的黄酮醇，分别属于槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）或异鼠李素（isorhamnetin）亚类，这些化合物通过鼠李糖和葡萄糖进行糖基化修饰。其中槲皮素-3-O-鼠李糖苷（quercitrin）是最主要的黄酮醇，还形成了全新的双黄酮醇类化合物（槲皮素-3-O-鼠李糖苷二聚体）。

空间分布分析显示，超过90%的槲皮素-3-O-鼠李糖苷及其相关二聚体主要沉积在种皮中，为分析增加了额外复杂性。研究还观察到发育种子中短暂积累的槲皮素-鼠李糖苷-己糖苷衍生物，该化合物在成熟种子中不存在。这些发现大大扩展了已知黄酮类结构的范围，揭示糖基化模式比预想的更为复杂。

原花青素氧化聚合的黑箱

原花青素（PAs）是由黄烷-3-醇缩合形成的无色黄酮聚合物，积累在内珠被特定细胞中。氧化作用使种子在成熟过程中呈现特征性棕色，但这也给PAs的提取和鉴定带来巨大挑战。

研究团队开发了双重分析方法，结合LC-MS分析单个PA单体和寡聚体，以及酸性水解后比色法评估可溶性和高度氧化的PAs。研究发现，表儿茶素和PA寡聚体主要积累在拟南芥种皮中。种子发育期间产生大量可溶性表儿茶素和PA寡聚体（可溶性和不溶性PAs分别高达280和200纳克/种子），但成熟种子中残留的可溶性PAs很少。

LC-MS分析首次在拟南芥中检测并定量了至少七种可溶性化合物，从单体表儿茶素到七聚体PAs。研究未检测到含有儿茶素、表没食子儿茶素、没食子儿茶素或表没食子儿茶素没食子酸酯的聚合物，表明拟南芥种子专门使用表儿茶素作为PAs的结构单元。

TT10突变体的深入表征

对tt10突变体的研究是先进技术应用的成功范例。TT10蛋白与漆酶样多酚氧化酶高度相似，该基因主要在发育种皮中表达，与两个黄酮终产物（原花青素和双黄酮醇）的积累时期一致。

LC-MS分析显示，tt10突变体种子比野生型积累更高水平的表儿茶素单体和可溶性原花青素。原位酶学分析表明，tt10突变体完整种皮细胞在表儿茶素和儿茶素存在下无法诱导褐变，而野生型细胞可以。研究还表征了脱氢双表儿茶素这一黄色二聚体，它是表儿茶素的主要氧化产物之一，在黄烷间连接方式上与PAs不同。此外，tt10种子中槲皮素鼠李糖苷单体与双黄酮醇二聚体的比率高于野生型。这些数据确证TT10在黄酮类化合物（包括黄酮醇和表儿茶素寡聚体）的氧化聚合中起关键作用，作为漆酶型黄酮氧化酶发挥作用。

拟南芥黄酮突变体的代谢缺陷表征

研究人员提供了11个影响关键结构或调控功能的突变体的首份黄酮谱。例如，影响查尔酮合成酶（CHS）的tt4突变体表现出黄酮类化合物的急剧减少，这与该突变中断黄酮合成的第一个关键步骤一致。该突变体作为阴性对照，揭示了所有潜在的黄酮相关化合物。

缺乏黄酮-3'-氧化酶（F3'H）的tt7突变体也很珍贵，它负责将山奈酚转化为槲皮素，可用于确认种子中山奈酚家族衍生物，并表征叶片中典型的额外糖基化黄酮醇。缺乏二氢黄酮醇还原酶（DFR）的tt3突变体缺少PAs，其底物重新导向槲皮素和异鼠李素黄酮醇。相反，fls1突变体显示黄酮醇合成减少，而可用中间体重新导向PA合成增加。

值得注意的是，fls1突变体仍积累显著黄酮醇水平。黄酮醇合成酶（FLS）、黄烷酮3-羟化酶（F3H）和花青素合成酶（ANS）催化中心C环的氧化修饰，它们高度相似，并显示至少部分催化彼此的反应。最近使用多个f3h、fls或ans突变体的研究表明，fls1突变体中剩余的黄酮醇是由于其他酶（如F3H或ANS）的双功能活性所致。

挖掘拟南芥种子黄酮多样性

在初步研究三个不同生态型（Ws-2、Col-0和Ler）的黄酮谱后，研究团队将分析扩展到四十一个生态型，以揭示物种范围内的多样性。还检查了来自不同生态型（Cvi-0×Col-0和Bay-0×Shahdara）的两个重组自交系（RIL）群体。

这些生态型和RILs主要表现定量而非定性变化。为解析这些差异背后的遗传结构，研究人员对两个分离群体进行了数量性状位点（QTL）分析，揭示了22个黄酮QTLs，解释11-64%的观察性状变异，两个RIL群体之间仅共享一个QTL。其中16个QTLs通过异质近交系（HIFs）验证并粗略定位。提出TT7、TT15和MYB12三个基因作为这些变异的关键驱动因子，相应突变体中类似的特定黄酮变化支持这一结论。重要的是，将可用候选突变体的黄酮谱与HIFs比较至关重要。值得注意的是，许多QTLs与当前已知影响黄酮代谢的基因不对应，突显了等待表征的未探索功能。

从拟南芥模型到其他植物

拟南芥种子黄酮分析为许多其他植物研究铺平了道路。例如，研究人员探索了相关十字花科油料作物种子的黄酮多样性，特别是油菜（Brassica napus）。分析了八个黑籽油菜基因型发育种子的黄酮含量，鉴定并定量了十三种不同黄酮类化合物。

这些黄酮醇、表儿茶素和PA衍生物首次在油菜种皮中检测和鉴定，与拟南芥中发现的类似。还鉴定了油菜中积累而拟南芥种子中没有的黄酮化合物，包括异鼠李素-己糖苷-硫酸盐和异鼠李素-芥子酰基-三己糖苷。原花青素聚合物也在种皮中高水平积累，溶剂可溶性表儿茶素形式在种子成熟期间占种皮重量的10%。与拟南芥一样，八个黑籽基因型面板主要表现定量变化。

最近，研究人员表征了亚麻荠（Camelina sativa）种子中黄酮和其他特化代谢物的多样性、可塑性和空间分布。首先分析了在露天地种植并连续五个生长季节收获的六个亚麻荠基因型种子的特化代谢物谱，实现了种子黄酮的全面注释，揭示环境因素对特化代谢物积累的影响大于基因型，黄酮醇的可塑性超过其他特化代谢物和主要种子储存化合物（如油脂和蛋白质）。此外，黄酮修饰（如丙二酰化、没食子酰化、阿魏酰化或酰化）受环境条件强烈影响。

在后续研究中，进行了多组学分析以确定亚麻荠种子发育和萌发期间种子代谢物（包括黄酮）的分布。与拟南芥中的发现类似，BANYULS同源物编码的花青素还原酶（ANR）蛋白在种皮早期发育阶段（授粉后13天）表达最高。相应地，原花青素衍生物（如儿茶素、表儿茶素和寡聚体）在13、21和28天时显示高积累。然而，它们的苷元形式（儿茶素和表儿茶素葡萄糖苷）以及大多数糖基化和酰化黄酮在种皮发育后期积累，与葡萄种子中观察到的模式平行，强调糖基化的稳定作用。理解种子黄酮和其他特化代谢物的空间动力学、修饰和调控机制将有助于优化有益和有害化合物的分布，提高种子质量和动物营养。这些研究说明种子代谢的动态和适应性性质及其对种子质量的直接影响。

研究意义与展望

这项工作为种子黄酮通路提供了一般描述，帮助鉴定拟南芥和其他植物物种中已知或新的黄酮化合物，建立黄酮分析和注释新方法，提供可应用于其他组织的知识，支持新突变体和基因的功能表征，帮助分析种子响应胁迫时黄酮和其他特化代谢物的积累。

当前，代谢组学与基因组学、转录组学、蛋白质组学（包括翻译后修饰）数据通过先进生物信息学、生物统计学和建模的整合，允许更好表征代谢通路，包括预测和鉴定参与黄酮修饰（如糖基化、酰化等）、转运、氧化和转录调控的新基因和酶。代谢组学进展与新的生物信息学注释工具和数据库开发并行，实现更精确注释和分类先前未知代谢物，揭示其功能多样性和生态相关性。在此背景下，机器学习和人工智能可能被使用。

代谢物在器官、组织和亚细胞水平的分布也是决定黄酮功能的关键因素。分子成像技术为可视化植物组织中黄酮的空间分布提供独特视角。使用簇飞行时间二次离子质谱成像技术的初步研究允许成像并确认拟南芥种皮中槲皮素的存在。增强此类成像技术可能有助于分析黄酮化合物（如PAs和黄酮醇）的空间动力学，并揭示新化合物。

这些知识提供有前景的生物技术解决方案，以开发更具韧性作物和可持续农业，使用更少化学投入保护植物免受生物和非生物胁迫，改善食品/饲料质量。例如，已获得积累叶部单宁的三叶草品系，减少反刍动物甲烷和氨排放；或培育产生黄色种子的亚麻荠、油菜和芥菜，具有改良油脂性状。控制黄酮生物合成通路的基因的基本见解（通常从拟南芥等模式物种获得）对于指导这些进展至关重要。涉及的许多转录因子（如MBW复合体中的MYB、bHLH和WDR）在植物物种间高度保守，实现知识从模型向作物的转移。历史上，这些基因也是育种和选择计划的目标（有意或无意地）以调节黄酮衍生代谢物的积累。例如，驯化和野生大豆之间的关键表型差异是成熟种子花青素缺失，与MBW组分的突变相关。类似黄酮相关性状的改变在豆类和谷物（包括水稻、小麦和大麦）的驯化和野生物种中观察到。黄酮（包括黄酮、黄酮醇和黄烷-3-醇）可能提供自然解决方案以减少农药使用，从而加强植物防御同时促进与生物防治剂的有益互作。尽管它们可能具有抗营养作用（如单宁与蛋白质相互作用），它们也展示显著有益特性（黄酮醇具有抗氧化特性，单宁对人类微生物组健康有积极影响）。关键问题在于在植物和种子发育期间维持黄酮的同时，最小化它们在食品或饲料产品中的不良存在。此外，最近显示人类肠道微生物组中存在的几种微生物进化出能代谢黄酮的酶，与其他苯丙素类一起，这在激活人体功能（包括抵抗肠道病原体）中起作用。在此背景下，精确表征和定量黄酮对于评估这些生物技术策略的效率和更广泛影响至关重要。