基于单克隆抗体的Nδ-(5-氢-4-咪唑啉-2-基)鸟氨酸(G-H1)形成抑制剂筛选新方法及其在动脉粥样硬化防治中的意义

本刊推荐：为开发动脉粥样硬化早期诊断新策略，研究人员针对糖尿病并发症关键因子——晚期糖基化终末产物(AGEs)中的G-H1，成功制备高特异性单克隆抗体1E9。通过建立ELISA筛选体系，首次实现游离G-H1抑制剂的快速检测，证实氨基胍(AMG)可浓度依赖性抑制G-H1形成（IC50≈1mM），为糖尿病血管并发症防治提供新靶点。

　　

在糖尿病全球流行的背景下，其并发症正严重影响着患者的生活质量并加剧医疗负担。慢性高血糖、炎症和氧化应激等因素共同导致了视网膜病变、肾病、神经病变及心血管疾病等严重并发症。其中，晚期糖基化终末产物(Advanced Glycation End-products, AGEs)作为一类由蛋白质与非酶性前体（如还原糖、脂质过氧化物）反应形成的物质，在糖尿病并发症的发病机制中扮演着关键角色。虽然糖化白蛋白和糖化血红蛋白HbA1c已成为糖尿病的常规诊断指标，但AGEs的积累不仅与糖尿病本身相关，更与其多种并发症的进展密切相关。

在众多AGEs中，Nδ-(5-氢-4-咪唑啉-2-基)鸟氨酸(G-H1)因其在2型糖尿病动脉粥样硬化进程中的特异性积累而备受关注。研究表明，血浆G-H1水平与颈动脉内膜中层厚度(CIMT)及冠状动脉钙化程度显著相关，提示其可能作为动脉粥样硬化的早期诊断标志物。然而，由于G-H1与其类似物G-H2、G-H3在结构上高度相似，传统分析方法难以实现特异性检测，且针对G-H1的特异性单克隆抗体一直未能成功制备，这严重阻碍了其相关研究和抑制剂开发。

为此，本研究团队在《Glycoconjugate Journal》发表了最新研究成果，旨在开发一种基于抗G-H1单克隆抗体的特异性检测方法，并建立高效抑制剂筛选平台。研究人员首先通过化学合成G-H1标准品，并利用核磁共振(NMR)和液相色谱-电喷雾离子化-四极杆飞行时间质谱(LC-ESI-QTOF)技术对其结构进行验证，确认合成产物为纯化的G-H1。随后，以G-H1-钥孔血蓝蛋白(G-H1-KLH)为免疫原免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合和筛选，成功获得一株高特异性抗G-H1单克隆抗体1E9。

通过竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)分析显示，1E9抗体对G-H1具有高度特异性，与G-H2、G-H3、Nε-(羧甲基)赖氨酸(CML)、Nε-(羧乙基)赖氨酸(CEL)、N-(5-氢-5-甲基-4-咪唑啉-2-基)-鸟氨酸(MG-H1)及精氨酸(Arg)等结构类似物均无交叉反应。进一步实验表明，在乙二醛(GO)修饰的精氨酸体系中，G-H1的形成在2 mM GO浓度时达到峰值，且ELISA与液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测结果高度一致。然而，在GO修饰的胶原蛋白和人血清 albumin(HSA)中未能检测到G-H1形成，提示该抗体主要识别游离形式的G-H1。

为建立抑制剂筛选体系，研究人员采用核糖-精氨酸反应体系，并加入不同浓度氨基胍(AMG)。结果显示，AMG以浓度依赖方式显著抑制G-H1形成，证实该筛选模型的有效性。本研究首次成功制备G-H1特异性单克隆抗体，为动脉粥样硬化早期诊断和防治提供了新工具，同时为高通量筛选G-H1抑制剂奠定了坚实基础。

主要关键技术方法包括：1）通过化学合成与色谱纯化制备G-H1标准品；2）利用LC-ESI-QTOF和变温NMR技术鉴定化合物结构；3）采用杂交瘤技术制备抗G-H1单克隆抗体；4）建立竞争性ELISA分析抗体特异性；5）结合LC-MS/MS验证G-H1形成条件及抑制剂效果。

Analysis of monoclonal anti-G-H1 antibody epitopes

通过竞争性ELISA分析证实，单克隆抗体1E9仅与G-H1发生浓度依赖性结合，与G-H2、G-H3、CML、CEL、MG-H1等结构类似物无交叉反应，表明其具有极高特异性。

Evaluation of antibody reactivity

在GO修饰精氨酸体系中，ELISA与LC-MS/MS检测均显示G-H1在2 mM GO浓度时形成量最高，10 mM时反而下降，证明该抗体可准确反映G-H1动态形成过程。

Evaluation of GO-derived AGE formation on collagen and human serum albumin(HSA)

在GO修饰的胶原蛋白和HSA中，CMA和CML的形成随GO浓度增加而上升，但G-H1未被检测到，提示1E9抗体可能无法识别蛋白结合态G-H1或该条件下无G-H1生成。

Establishment of a screening system for G-H1 inhibitors

采用核糖-精氨酸反应体系验证氨基胍(AMG)的抑制效果，显示AMG在0.001-2 mM范围内浓度依赖性抑制G-H1形成，为抑制剂筛选提供可靠模型。

研究结论表明，G-H1作为糖尿病动脉粥样硬化的潜在生物标志物，其特异性检测和抑制剂开发具有重要临床意义。本研究成功制备的首个抗G-H1单克隆抗体1E9，不仅能准确区分G-H1与其类似物，还可用于高通量筛选抑制剂。尽管该抗体目前仅适用于游离G-H1检测，且未能识别蛋白结合形式，但为探索G-H1在动脉粥样硬化形成中的作用机制提供了关键工具。未来研究可进一步优化抗体性能，拓展其在组织染色和血清检测中的应用，为糖尿病血管并发症的早期干预开辟新途径。