基于关键配体-受体对构建膀胱癌预后模型及免疫治疗预测

《Hormones & Cancer》：Prognostic analysis and immunotherapy prediction based on key receptor-ligand pairs of bladder cancer

本研究针对膀胱癌患者预后差、复发转移率高及免疫治疗响应率低的临床难题，通过整合单细胞测序与TCGA等大样本数据，筛选出CXCL12_CXCR4等5个关键配体-受体对，构建了LR.Riskscore预后模型。该模型不仅能有效预测患者生存，还成功预测了免疫检查点抑制剂Atezolizumab的疗效，并通过体外实验验证了CXCR4在膀胱癌细胞增殖和迁移中的关键作用，为膀胱癌的精准治疗提供了新策略。

　　

膀胱癌是全球泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，尽管手术、化疗和免疫治疗等手段不断进步，但其高复发率、高转移率以及耐药性仍是导致患者预后不良的主要原因。据统计，发生转移的膀胱癌患者5年生存率仅为4.6%。因此，深入理解膀胱癌的发病机制，寻找有效的预后标志物和新的治疗靶点，是当前临床面临的迫切需求。

近年来，肿瘤微环境（TME）在肿瘤发生发展中的作用日益受到重视。肿瘤并非由单一的癌细胞构成，而是由癌细胞、免疫细胞、癌症相关成纤维细胞（CAF）、内皮细胞等多种细胞组成的复杂生态系统。这些细胞之间通过复杂的信号网络进行“对话”，共同塑造了肿瘤的恶性特征。然而，传统的二代测序技术无法解析单个细胞间的异质性和相互作用，这限制了我们从细胞层面理解肿瘤的复杂性。

随着单细胞测序技术的发展，科学家们得以在单细胞分辨率下描绘肿瘤的细胞图谱，并深入探究细胞间的通讯网络。为了揭示膀胱癌中细胞间通讯的奥秘，并为患者提供更精准的预后评估和免疫治疗指导，来自中南大学湘雅医院等机构的研究团队在《Discover Oncology》上发表了题为“Prognostic analysis and immunotherapy prediction based on key receptor-ligand pairs of bladder cancer”的研究。该研究整合了单细胞测序和公共数据库数据，成功构建了一个基于关键配体-受体对（LR-pairs）的膀胱癌预后模型，并证实该模型能有效预测患者的生存和免疫治疗反应。

关键技术方法概览

本研究采用了多组学数据整合与实验验证相结合的策略。首先，研究人员利用公共数据库中的膀胱癌单细胞测序数据（BioProject-PRJNA662018），通过Seurat软件包进行细胞聚类和注释，识别出8种主要细胞类型。随后，利用CellChat软件分析细胞间的通讯网络，筛选出肿瘤恶性上皮细胞与其他细胞亚群之间重要的配体-受体对。接着，结合TCGA-BLCA数据库的转录组数据和临床信息，通过Cox回归和LASSO回归分析，筛选出与预后最相关的5个关键配体-受体对，并构建了风险评分模型（LR.Riskscore）。该模型在TCGA、GSE13507以及湘雅医院队列中进行了验证。最后，通过体外细胞实验（包括qRT-PCR、Western Blot、CCK8、克隆形成、Transwell和划痕实验）验证了关键受体CXCR4在膀胱癌细胞增殖和迁移中的功能。

研究结果

1. 膀胱癌单细胞图谱与细胞间通讯网络

研究人员首先对来自8个肿瘤组织和3个癌旁组织的单细胞测序数据进行了分析，共纳入55,054个细胞。通过降维聚类，成功识别出8种主要细胞类型，包括上皮细胞、炎性癌症相关成纤维细胞（iCAF）、肌成纤维细胞样癌症相关成纤维细胞（mCAF）、髓系细胞、T细胞、B细胞、内皮细胞和肥大细胞。基因集变异分析（GSVA）显示，上皮细胞中富集了DNA修复和上皮-间质转化（EMT）通路，而髓系细胞则富集了炎症反应通路。

为了探究细胞间的“对话”，研究人员利用CellChat软件分析了肿瘤样本中的细胞通讯。结果发现，iCAF是肿瘤微环境中信号交流最活跃的细胞亚群，其与上皮细胞之间的相互作用强度最高。通过分析，研究团队筛选出了肿瘤恶性上皮细胞与其他细胞亚群之间存在的配体-受体对，为后续研究奠定了基础。

2. 基于配体-受体对的分子分型及其特征

为了将单细胞层面的发现与临床预后联系起来，研究人员利用TCGA数据库，通过Cox回归分析筛选出52个与患者预后显著相关的配体-受体对。基于这些配体-受体对的表达水平，研究人员将TCGA队列中的411名膀胱癌患者分为三个分子亚型（C1、C2、C3）。生存分析显示，这三个亚型的预后存在显著差异，其中C1亚型预后最差，C3亚型预后最好。这一分型结果在GSE13507队列和湘雅医院队列中也得到了验证。

进一步分析发现，不同分子亚型具有不同的基因组特征。C1亚型（预后差）的TP53基因突变频率显著高于其他亚型，且肿瘤突变负荷（TMB）更高。此外，C1亚型还表现出更高的免疫细胞浸润水平，包括肥大细胞、NK T细胞和髓系来源的抑制性细胞（MDSC）。功能富集分析表明，C1亚型中富集了免疫系统抑制、白细胞迁移和趋化等通路，这可能是其预后较差的原因之一。

3. 构建并验证基于配体-受体对的风险评分模型

为了构建一个更精准的预后预测工具，研究人员对上述52个预后相关的配体-受体对进行了LASSO Cox回归分析，最终筛选出5个关键配体-受体对，并构建了风险评分模型（LR.Riskscore）。这5个关键对分别是：CXCL12_CXCR4、VEGFA_FLT1、PDGFC_PDGFRA、WNT2_SFRP4和HLA-E_KLRC1。

LR.Riskscore的计算公式为：

LR.Riskscore = 0.481 * CXCL12_CXCR4 + 0.276 * VEGFA_FLT1 + 0.104 * PDGFC_PDGFRA + 0.056 * WNT2_SFRP4 + 0.031 * HLA-E_KLRC1

根据风险评分的中位数，患者被分为高风险组和低风险组。生存分析显示，在TCGA、GSE13507和湘雅医院三个独立队列中，高风险组患者的生存率均显著低于低风险组。时间依赖性ROC曲线分析显示，该模型在预测1年、3年和5年生存率方面表现出色（AUC分别达到0.82、0.87和0.89）。多因素Cox回归分析证实，LR.Riskscore是预测患者预后的独立危险因素，其预测能力优于年龄、性别、临床分期等传统指标。决策曲线分析（DCA）也表明，该模型能为患者带来更大的临床净获益。

4. 体外实验验证关键受体CXCR4的功能

为了验证关键配体-受体对在膀胱癌中的生物学功能，研究人员首先通过qRT-PCR证实，这5个关键对在膀胱癌细胞系T24中的表达均显著高于正常膀胱细胞。其中，CXCR4在肿瘤恶性上皮细胞中高表达，并通过CXCL12-CXCR4轴与周围基质细胞和免疫细胞相互作用。

为了探究CXCR4的具体作用，研究人员在膀胱癌细胞中敲低了CXCR4的表达。体外功能实验结果显示，敲低CXCR4后，膀胱癌细胞的增殖能力（CCK8和克隆形成实验）和迁移能力（Transwell和划痕实验）均显著降低。这些结果证实了CXCR4在促进膀胱癌细胞恶性进展中的关键作用。

5. 风险评分模型与免疫治疗反应预测

最后，研究人员探讨了LR.Riskscore与免疫治疗反应的关系。分析发现，高风险组患者的肿瘤微环境中免疫细胞浸润水平更高，且风险评分与多种免疫检查点分子（如CD274、PDCD1、PD-L2、HAVCR2）的表达呈正相关。这表明高风险患者可能处于免疫抑制状态，对免疫治疗的反应可能更差。

为了验证这一猜想，研究人员利用接受Atezolizumab（一种PD-L1抑制剂）治疗的膀胱癌患者队列（IMvigor210）进行了分析。结果证实，低风险组患者的生存率显著高于高风险组。此外，在获得完全缓解（CR）或部分缓解（PR）的患者中，LR.Riskscore显著低于疾病稳定（SD）或疾病进展（PD）的患者。这表明LR.Riskscore能够有效预测膀胱癌患者对免疫治疗的反应。

结论与讨论

本研究成功构建了一个基于关键配体-受体对（CXCL12_CXCR4、VEGFA_FLT1、PDGFC_PDGFRA、WNT2_SFRP4、HLA-E_KLRC1）的膀胱癌预后模型（LR.Riskscore）。该模型不仅能有效预测患者的生存预后，还能预测患者对免疫检查点抑制剂的治疗反应。通过体外实验，研究团队进一步证实了关键受体CXCR4在促进膀胱癌细胞增殖和迁移中的重要作用。

这项研究的创新之处在于，它从单细胞层面揭示了膀胱癌肿瘤微环境中细胞间的通讯网络，并将这些发现转化为一个具有临床实用价值的预后和疗效预测模型。与传统的基于单个基因或蛋白的研究相比，该模型更全面地反映了肿瘤微环境的复杂性。此外，该研究不仅通过生物信息学分析提出了假设，还通过体外细胞实验进行了功能验证，增强了结论的可靠性。

尽管该研究为膀胱癌的精准治疗提供了新的思路，但作者也指出了其局限性。例如，这是一项回顾性研究，未来需要在前瞻性队列中进行验证；目前的研究主要集中于尿路上皮癌，对于其他罕见病理类型的预测能力尚不明确；此外，除了CXCR4，其他关键配体-受体对的生物学功能也需要进一步探索。

总之，这项研究为膀胱癌的预后评估和免疫治疗选择提供了有力的工具，有望推动膀胱癌的精准、个体化治疗策略的发展。