脐血来源CAR-T与NK细胞生产中的活化与培养条件优化研究

本文系统优化了脐血（CB）来源CAR-T/NK细胞的活化与培养体系，发现相较于外周血（PB），CB来源的幼稚T细胞（CD45RA+CD197+）和未成熟NK细胞（CD56+CD57?）比例更高，更易激活且不易衰竭。研究明确了CB-T细胞最佳细胞因子组合为IL-2+IL-7+IL-15（各40 U/mL），CB-NK细胞为IL-2（40 U/mL）+IL-15（200 U/mL），并通过杀伤实验和信号通路（JAK/STAT、PI3K/Akt）验证其增强抗肿瘤效果。此外，瑞舒伐他汀可通过上调LDL-R显著提高CAR-NK细胞的慢病毒转导效率。该研究为开发即用型（off-the-shelf）细胞疗法提供了关键工艺优化方案。

　　

引言

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法已成为复发/难治性B细胞恶性肿瘤的有效治疗策略。目前所有获批的CAR-T产品均来源于患者外周血（PB），但从单采到输注需经历1-2个月的桥接化疗期，这对病情危重患者可能是致命的。此外，既往化疗可能导致淋巴细胞衰竭，造成生产失败。因此，近年来研究者致力于开发即用型（off-the-shelf）CAR-T产品，其中脐血（CB）因其低移植物抗宿主病风险而成为极具潜力的细胞来源。然而，CB与PB淋巴细胞在组成和成熟度上存在差异，直接沿用PB的活化培养条件可能并非最优。本研究旨在系统优化CB来源CAR-T/NK细胞的活化与培养条件，以实现高效激活的同时避免过度衰竭。

材料与方法

研究于2024年7月至2025年3月开展。PB取自三名健康成人志愿者，CB由日本RIKEN生物资源研究中心提供。采用淋巴细胞分离液及CD4/CD8、CD56磁珠分选T/NK细胞，使用TexMACS和NKMACS培养基在37°C、5% CO₂条件下培养。评估了IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21等多种细胞因子（均采用GMP级别，初始浓度40 U/mL）的不同组合与浓度效应。通过流式细胞术（FACS）分析活化标志物（T细胞：CD25/CD69；NK细胞：CD226/CD16）和衰竭标志物（PD-1/TIM-3），并采用细胞内FACS技术分析磷酸化信号蛋白（如pSTAT3、pSTAT5、pAkt、pmTOR）。采用CD3/CD28激动剂刺激T细胞，利用第三代慢病毒载体（携带CD19靶向CAR）转导生产CAR-T/NK细胞，并通过CFSE染色杀伤实验评估抗肿瘤效果。所有实验重复五次，采用STATA 16.0进行统计分析。

结果

T细胞亚群在PB与CB中的差异

CB与PB的CD3⁺细胞比例相当（中位数56.5% vs. 53.9%），但CB的CD4/CD8比值更高（2.88 vs. 1.75），且幼稚T细胞（CD45RA⁺CD197⁺）比例显著高于PB（90.3% vs. 37.8%）。

T细胞活化最佳细胞因子组合与浓度

研究发现，添加IL-2、IL-7和IL-15可增加PB和CB T细胞的活化比例，但细胞因子数量与衰竭程度呈正相关，其中IL-2尤其促进衰竭，而IL-15可抑制衰竭。CB-T细胞比PB-T细胞更易激活且不易衰竭。最佳平衡条件为：PB-T细胞采用40 U/mL IL-7+40 U/mL IL-15，CB-T细胞采用40 U/mL IL-2+40 U/mL IL-7+40 U/mL IL-15。

T细胞信号通路分析

细胞内FACS显示，经最佳细胞因子刺激后，PB和CB T细胞中pSTAT3和pSTAT5的荧光强度显著升高，表明JAK/STAT通路被激活。

CD3/CD28激动剂刺激的影响

CD3/CD28激动剂可显著促进T细胞活化，但对增殖和衰竭影响较小，证实其在T细胞激活中的关键作用。

T细胞培养时间进程

培养2周内T细胞数量持续增加，活化标志物水平在培养2-3天后达峰后下降，衰竭标志物水平在2-3天后进入平台期。

CAR-T细胞性能评估

在杀伤实验中，采用优化条件的PB-CAR-T（IL-7+IL-15）和CB-CAR-T（IL-2+IL-7+IL-15）均显示更高肿瘤细胞裂解率（分别为77.8%和80.9%），且CB-CAR-T在活化、细胞因子（IFN-γ、TNF-α）分泌方面均优于PB-CAR-T。

NK细胞亚群在PB与CB中的差异

CB中未成熟NK细胞（CD56⁺CD57^?）比例显著高于PB（15.72% vs. 5.35%）。

NK细胞活化最佳细胞因子组合与浓度

IL-2和IL-15可有效激活NK细胞，但IL-2也会促进衰竭。CB-NK细胞比PB-NK细胞更易激活且不易衰竭。最佳平衡条件为：PB-NK细胞采用40 U/mL IL-2+40 U/mL IL-15，CB-NK细胞采用40 U/mL IL-2+200 U/mL IL-15。

NK细胞信号通路分析

经最佳细胞因子刺激后，PB和CB NK细胞中pAkt和pmTOR荧光强度显著升高，表明PI3K/Akt/mTOR通路被激活。

NK细胞培养时间进程

NK细胞数量在培养1-2周内快速增长，活化标志物水平在2-3天后达峰且下降速度慢于T细胞，衰竭标志物水平在2-3天后进入平台期。

瑞舒伐他汀增强转导

瑞舒伐他汀可上调LDL-R表达，显著提高PB和CB CAR-NK细胞的慢病毒转导效率（p<0.01）。

CAR-NK细胞性能评估

在杀伤实验中，采用优化条件的CB-CAR-NK（IL-2+200 U/mL IL-15）显示更高肿瘤细胞裂解率（68.5% vs. 60.4%）和活化标志物表达，且细胞因子分泌更优。

讨论

本研究首次系统优化了CB来源CAR-T/NK细胞的活化与培养条件，发现CB淋巴细胞因更幼稚的状态而更易激活且抗衰竭能力更强。最佳细胞因子组合通过激活JAK/STAT（T细胞）和PI3K/Akt（NK细胞）通路增强细胞功能。瑞舒伐他汀可通过上调LDL-R有效解决NK细胞转导难题。时间进程分析为确定最佳收获时间提供了依据。尽管本研究存在样本量有限、细胞因子范围未全覆盖、缺乏体内验证等局限，但结果为开发高效即用型CB-CAR-T/NK疗法奠定了坚实基础，未来有望惠及更多患者。

作者贡献与致谢

NN、YS和TO设计研究并组织项目，NN完成实验，JL、YS、MT、HK、YK、YH、AT-K和TO参与数据解读。所有作者审阅并认可稿件。感谢东京大学医学科学研究所所有技术支持人员及Miltenyi Biotec提供的培养基与试剂。

资金与利益冲突

本研究获日本学术振兴会（JSPS） fellowship（24KJ0987）及日本医疗研究开发机构（AMED）资助（JP24bm1523001、JP24bm1523007）。作者声明无利益冲突。

伦理声明

研究遵循赫尔辛基宣言，并经东京大学医学科学研究所伦理委员会批准。