性染色体非整倍性通过DNA甲基化时钟揭示的衰老调控新机制

本综述系统探讨了性染色体剂量对表观遗传衰老的影响，通过分析不同核型（46,XX/46,XY/47,XXY/47,XYY）的DNA甲基化（DNAm）模式，发现47,XXY个体表现出更慢的GrimAge加速和DunedinPACE衰老速率，揭示了X染色体剂量增加与免疫衰老减缓的潜在关联，为性染色体相关衰老机制提供了新的分子视角。

1 引言

寿命的性别差异在自然界和人类中普遍存在，女性通常比男性寿命更长。关于这种差异的解释有多种理论，包括性染色体的作用（如"无保护的X染色体"假说和"有毒Y染色体"假说）、母系诅咒理论以及性别差异的生命史策略理论。在人类中，性激素、线粒体突变、文化环境因素等都可能贡献于寿命的性别差距。然而，性染色体对人类特异性寿命的影响尚未被深入探索。研究人类性染色体非整倍性为评估性染色体如何贡献于寿命的性别差异提供了途径。人口数据显示，47,XYY（雅各布综合征）患者的寿命缩短约10年，而47,XXY（克兰费尔特综合征）患者的寿命缩短约2年。

DNA甲基化（DNAm）随时间的推移而变化，使得构建"表观遗传时钟"成为可能，这些时钟显示出表观遗传年龄与chronological age之间的强相关性。第一代时钟（如Horvath的泛组织时钟、Skin & Blood时钟和Hannum的血液时钟）旨在估计chronological age，而第二代时钟（如PhenoAge和GrimAge）则旨在估计死亡风险。GrimAge整合了多个DNAm替代血浆蛋白和吸烟包年的指标，对疾病发生和全因死亡率具有高预测能力。DunedinPACE时钟则测量衰老的 pace，其与chronological age的相关性较弱（通常r=0.2至0.5）。为了消除chronological age的混淆效应，研究人员使用表观遗传年龄加速（EAA），定义为表观遗传年龄估计值与chronological age回归后的残差。较高的EAA与年龄相关疾病风险增加和死亡时间缩短相关。

本研究检测了广泛使用的表观遗传时钟在46,XX女性、46,XY男性、47,XXY男性、47,XYY男性以及性发育差异（DSD）个体（表现为女性的46,XY完全雄激素不敏感综合征（CAIS）和表现为男性的46,XX SRY阳性个体）中的表现，以测试表观遗传年龄是否取决于核型的性染色体组成。

2 结果

2.1 表观遗传年龄估计值与Chronological Age强烈相关

分析显示，第一代和第二代表观遗传时钟与采血时的chronological age均呈现预期的强正相关。此外，chronological age与基于DNA甲基化的端粒长度估计值呈现强负相关。

2.2 GrimAge：47,XXY的表观遗传年龄低于46,XY和46,XX

由于GrimAge将性别作为协变量，为了分离核型效应，将所有样本的性别设置为“女性”（恒定值1）。GrimAge时钟表明，47,XXY男性的表观遗传年龄低于46,XY男性和46,XX女性（分别为p < 0.05和p < 0.001）。类似地，经年龄调整的甲基化端粒长度估计值（“端粒甲基化时钟”）表明，47,XXY男性的端粒长度估计值比46,XY男性更长（p < 0.05），进一步支持了这些个体甲基组更年轻的观点。

相比之下，Skin & Blood时钟表明，47,XXY男性和47,XYY男性的表观遗传年龄比46,XY男性更老（均p < 0.01）。这突显了一个关键差异：第二代时钟（如GrimAge）与第一代时钟（如Skin & Blood时钟）关于47,XXY男性的结论不同。DunedinPACE的结果如下所述。

2.3 GrimAge的基于DNAm的组成部分

GrimAge时钟定义为八个基于DNAm的组成部分的线性组合，这些部分估计血浆蛋白和吸烟包年。具有负权重的组成部分在增加时会降低GrimAge估计值，而具有正权重的组成部分则会提高它。除DNAmLeptin外，所有组成部分在GrimAge模型中都具有正系数。研究人员检查了这八个基于DNAm的组成部分在调整chronological age并将性别保持为协变量后，在不同核型间是否存在差异。除DNAmB2M外，七个组成部分在各种两两比较中显示出名义上的显著差异。

首先，与具有一条X染色体的个体（46,XY；46,XY CAIS；47,XYY）相比，具有两条X染色体的个体（46,XX；46,XX SRY+；47,XXY）的DNAmLeptin和DNAmADM水平显著更高（p < 0.001）。高DNAmADM（肾上腺髓质素）水平可预测死亡风险，而先前研究表明DNAmLeptin不能正向预测死亡率。其次，基于甲基化的吸烟替代指标DNAmPACKYRS在47,XXY男性中显著低于46,XY男性（p < 0.01）。这可能部分反映了47,XXY个体（22.2%，n=9）相对于46,XY个体（37.5%，n=16）吸烟 prevalence 较低。

这些发现有助于解释为什么GrimAge时钟在47,XXY个体中产生的值低于46,XY个体。一个关键因素是DNAmLeptin，它在模型中具有负系数：47,XXY个体中较高的DNAmLeptin降低了相对于46,XY男性的GrimAge。类似地，DNAmPACKYRS具有正系数，因此其在47,XXY个体中的较低值也有助于降低GrimAge。相比之下，同样具有正系数的DNAmADM并不能解释47,XXY个体中较低的GrimAge，因为它的值是升高而非降低。总之，DNAmLeptin和DNAmPACKYRS是观察到的47,XXY个体年龄加速降低的最可能驱动因素。

最后，研究人员注意到，与46,XY男性相比，47,XYY中的DNAmTIMP1升高（p < 0.01）。TIMP1是细胞外基质转换的调节因子，升高的TIMP1水平通常与纤维化状况相关。

2.4 DunedinPACE证实了GrimAge的结果

DunedinPACE时钟表明，47,XXY男性的衰老 pace 慢于46,XY男性（p < 0.05）和46,XX女性（p < 0.001）。这种模式反映了GrimAge的结果，即47,XXY男性相对于两个比较组显示出较低的年龄加速。此外，47,XXY男性的衰老 pace 慢于47,XYY男性（p < 0.05）。

2.5 与T细胞衰老相关的血细胞计数

研究人员根据Horvath等人的方法从DNAm估计了两个细胞毒性T细胞指标：衰竭的CD8⁺ (CD8⁺CD28^?CD45RA^? AdjAge) 和初始CD8⁺ T细胞。在调整chronological age后，估计的衰竭CD8⁺ T细胞丰度在47,XXY和46,XY之间没有差异，而估计的初始CD8⁺ T细胞在47,XXY中更高（p < 0.05），与更年轻的细胞毒性T细胞区室一致。总体而言，这表明47,XXY个体的细胞毒性CD8⁺ T细胞在生物学上比46,XY个体的更年轻。

2.6 核型的表观基因组关联研究（EWAS）

X染色体上的许多CpG在具有多于一条X染色体的个体中高度甲基化，反映了X失活的影响。为了避免这种混淆效应，分析集中在常染色体CpG上。使用线性回归模型，研究人员在调整年龄的同时进行了常染色体CpG甲基化的表观基因组关联研究（EWAS）。检查了三个比较：(i) 47,XXY vs. 46,XY，(ii) 47,XXY vs. 46,XX，和 (iii) 47,XYY vs. 46,XY。对于功能富集分析，使用了GREAT工具。将每个EWAS中最显著的4000个CpG分为2000个高度高甲基化位点（正关联）和2000个高度低甲基化位点（负关联）输入GREAT。

对47,XXY与46,XY差异甲基化CpG的GREAT分析揭示了免疫相关通路的富集。低甲基化CpG与涉及淋巴细胞活化和T细胞分化的基因相关，以及自身免疫疾病特征如系统性红斑狼疮（FDR = 8.4 × 10^?9）。其他富集包括钙粘蛋白信号传导和发育异常，如Arnold-Chiari畸形。相比之下，高甲基化CpG富集了与神经和血液疾病（如不宁腿综合征、半侧肥大）、细胞周期调控（极光B信号传导、stathmin家族）和癌症相关通路（急性早幼粒细胞白血病、亨廷顿病）相关的基因。这些结果表明，47,XXY以免疫调节基因以及细胞周期控制和神经功能相关位点的甲基化变化为特征。

当比较47,XXY与46,XX个体时，低甲基化CpG再次显示出免疫活化通路的强富集，包括T细胞活化、趋化因子受体信号传导和异常T细胞数量（FDR = 6.2 × 10^?19）。最显著的富集是自身免疫相关特征（例如，系统性红斑狼疮CD4 T细胞 vs. B细胞；FDR = 1.4 × 10^?68），强调了47,XXY与改变的免疫表观遗传谱之间的一致关联。相比之下，高甲基化CpG富集了代谢和癌症相关过程，包括II型糖尿病、腺癌、蛋白质代谢和mRNA剪接。总之，这些发现表明47,XXY与改变甲基化的双重模式相关，涉及免疫信号通路的上调以及代谢和致癌通路的转变。

当比较47,XYY与46,XY个体时，低甲基化CpG富集了涉及氨基酸转运和代谢的基因，以及免疫反应，如LPS刺激的单核细胞活化和干扰素相关通路。另一方面，高甲基化CpG突出了与肾功能障碍（异常肾脏形态、慢性移植排斥）、免疫失调（HIV感染通路、B细胞亚群）和FGF信号传导相关的过程。因此，虽然47,XYY与47,XXY共享免疫相关表观遗传变化的模式，但它也显示出在肾脏和代谢通路中的独特富集。

总体而言，这些GREAT分析揭示，47,XXY和47,XYY都以广泛的免疫相关表观遗传改变为标志，特别是涉及T细胞功能和自身免疫。同时，更广泛的生物学后果似乎不同：47,XXY显示出与代谢和癌症相关通路的更强联系，而47,XYY则与肾脏生物学和氨基酸代谢更密切相关。这些通路富集与已知的性染色体非整倍性之间的临床差异一致：47,XXY与自身免疫、代谢、血栓形成和特定癌症风险增加相关，而47,XYY显示呼吸系统和神经发育发病率升高，疾病负担广泛增加。因此，这里观察到的 distinct 富集谱可能有助于解释不同核型间健康风险的差异；47,XYY中的肾脏通路信号应仅在获得更强流行病学证实前被视为假设生成。

3 讨论

使用下一代DNA甲基化（DNAm）时钟，研究人员观察到47,XXY个体表现出比46,XY和46,XX更慢的表观遗传衰老：GrimAge时钟显示较低的年龄加速，DunedinPACE表明47,XXY的衰老 pace 更慢。相比之下，第一代Skin & Blood时钟表明47,XXY和47,XYY相对于46,XY具有更高的年龄加速。这些不同的模式反映了不同时钟捕获 distinct 的表观遗传衰老领域。

GrimAge与免疫衰老相关。与更慢的免疫衰老一致，47,XXY个体显示出更高的估计初始CD8⁺ T细胞丰度，这是一个随年龄增长而下降的亚群，并有助于免疫衰老。先前的工作也报道了47,XXY中比46,XY更高的CD8⁺ T细胞计数。多组学分析表明47,XXY和46,XY之间存在广泛差异，包括X连锁高甲基化和免疫基因失调。健康女性和47,XXY患者中X连锁TLR7和CD40L的过表达支持X剂量对先天和适应性反应的影响。女性更强大的免疫 tone 伴随着更高的自身免疫性；47,XXY中类似的趋势可能有助于解释他们对自身免疫疾病的易感性。此外，47,XXY患者在全血中显示较低的细胞因子炎症反应，具有女性样的产生模式，在调整性类固醇后仍然存在——暗示性染色体而非激素在细胞因子谱中的作用。PAI-1与促炎状态相关，其DNAm替代物与炎症相关；研究人员发现47,XXY与46,XY相比DNAmPAI1较低的提示性证据（p = 0.09）。临床记录显示大多数患者没有骨质疏松症，与保留的免疫-骨骼串扰兼容，但这需要确认。

端粒发现在各研究中好坏参半。年轻的47,XXY患者（18-24岁）可能具有更长的端粒，这种差异可能随年龄增长而减弱；端粒缩短与B细胞急性淋巴细胞白血病有关。在我们14.9-30.4岁的队列中，基于DNAm的端粒长度在47,XXY中比46,XY更长，这种效应可能反映了年龄范围。通常，DNAmTL与实际端粒长度（基于PCR测量或Southern印迹）不同。DNAmTL与实际白细胞端粒长度仅中度相关（r ≈ 0.4）。

寿命略微缩短（约2年）和广泛的合并症负担可在47,XXY男性中观察到，包括感染和自身免疫疾病风险、乳腺和纵隔肿瘤、内皮功能障碍、心脏异常包括短QTc、低骨密度/骨质疏松症、抽动障碍、血脂异常和肥胖、糖尿病、认知和神经解剖学差异、性腺功能减退/无精子症、肌肉力量减少和运动发育延迟。出乎意料的是，我们的表观遗传结果表明47,XXY男性比46,XY男性表观遗传衰老更慢。最近的一项研究报道，与匹配的46,XY对照组相比，47,XXY的估计10年生存率（Charlson合并症指数）较低，但死亡年龄没有差异。这种明显的悖论可能源于死亡率是由GrimAge/DunedinPACE捕获范围之外的因素驱动的，例如社会经济决定因素（在美国预期寿命差距>10年）。额外的生物学假设包括通过额外的X减轻“无保护的X”效应；鉴于不育症，资源分配/生殖成本差异以及与减少雄激素暴露的相似之处；狗绝育后寿命更长；羊阉割后表观遗传衰老更慢；以及生存选择有利于存活下来的47,XXY中有害变异负担较低。这些发现仍然是假设生成的。

研究人员还注意到，47,XYY在Skin & Blood时钟上显示出最高的加速，强调估计chronological age的第一代时钟与连接发病率/死亡率的下一代时钟可能会分化，并应根据其 distinct 定义进行解释。

3.1 局限性

此处评估的一些生物标志物，如GrimAge和DNAmLeptin，包括X染色体CpG。由于许多X连锁CpG在核型包含>1条X染色体时由于X失活而高度甲基化，此类模型原则上可能在47,XXY中引入人为关联。排除X连锁CpG的DunedinPACE仍然显示出相同的效应方向（47,XXY < 46,XY），部分缓解了这种担忧。更广泛地说，这些时钟主要是在整倍体人群中训练的，因此校准和绝对估计在性染色体非整倍体中可能不同。

研究人群主要是年轻人和横断面；然而，先前对年轻人的工作能够突出EAA。尽管如此，无法确定47,XXY与46,XY的GrimAge/DunedinPACE差异在老年时是否持续、减弱或逆转。我们数据集中跨时钟的分化信号（47,XXY中较低的GrimAge和DunedinPACE与较高的Skin & Blood）强调了进行纵向、跨年龄研究的必要性。

样本量限制了统计功效和协变量控制。更大的队列应更充分地模拟BMI、社会决定因素、睾酮和其他性类固醇、医疗史、吸烟（状态、强度、持续时间）以及药物/治疗暴露（包括睾酮剂量和持续时间）。吸烟 prevalence 的差异即使在使用DNAmPACKYRS时也可能留下残留混淆。

确认和生存偏差是可能的：47,XXY组包括临床诊断的寻求生育力保存的个体，可能不代表未诊断的47,XXY。临床确认与结果相关（诊断的47,XXY显示比未诊断的47,XXY更高的估计10年生存率），可能偏倚效应估计。

分析使用了血液，而DNAm是组织特异性的。免疫通路富集可能反映了调控变化和细胞组成差异；研究人员依赖基于DNAm的细胞估计而非直接细胞计数。同样，蛋白质（例如leptin、PAI-1）的DNAm替代物未在本队列中针对血浆测量进行验证，这应在未来研究中进行。技术/分析因素（例如平台和标准化选择）和潜在的批次效应也可能增加噪音。基因集富集（例如GREAT）取决于背景、本体论管理和我们的顶级CpG阈值（2000个高/2000个低），因此通路结果应被视为假设生成。

由于空间限制，未调查额外的表观遗传时钟。我们的46,XY与47,XXY发现与使用三CpG时钟报道无加速的更大规模研究不同。

GrimAge并不等同于死亡风险。虽然两者显著相关，但它们代表 organismal aging 的不同衡量标准。表观遗传生物标志物如GrimAge仅捕获众多贡献于死亡风险的生物和临床指标中的一个维度。总体而言，分子分析侧重于DNAm时钟和基于DNAm的细胞估计；未评估替代的衰老生物标志物（例如蛋白质组学、线粒体、代谢组学、糖组学或免疫功能测量），这对于整合性、机制性推断很重要。

4 结论

总之，47,XXY显示出比46,XY更低的GrimAge加速和更慢的DunedinPACE，以及更长的基于DNAm的端粒估计值。更高的初始CD8⁺ T细胞估计值支持47,XXY中减少的免疫衰老。研究人员假设X染色体剂量和下游的免疫及激素效应 contribute to these patterns；然而，需要更大规模、机制性和纵向研究来调和时钟分化与临床结果，并定义性染色体如何塑造人类衰老。

5 方法

5.1 生物材料

该研究经里昂大学医院伦理委员会批准（伦理委员会编号：22_385，国家信息与自由委员会注册号：22_5385）。共纳入54个体。33个体具有正常染色体核型（17名46,XX女性和16名46,XY男性）；他们是患有相对常见的常染色体隐性遗传病（囊性纤维化或先天性肾上腺增生）个体的无症状伴侣。14个体有性染色体非整倍性（9名47,XXY男性和5名47,XYY男性），4个体为46,XX SRY阳性导致男性表型，3名为46,XY具有突变雄激素受体导致完全雄激素不敏感综合征（CAIS）表现为女性表型（46,XY CAIS）。47,XXY、47,XYY、46,XX SRY阳性和46,XY CAIS个体招募自里昂大学医院的生育力保存或遗传单元。个体年龄范围从14岁到39岁，54人中有14人是当前吸烟者。采集EDTA血液样本并使用Macherey-Nagel（Hoerdt, France）的Nucleospin Blood L Vacuum kit在microlab STARlet提取器（Hamilton, Nevada, USA）中提取DNA。DNA提取物在分析前保存在4°C。使用Quant-iT 1X ds DNA HS Assay kit（ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA）和EnSpire Plate Reader（PerkinElmer, Massachusetts, USA）通过荧光测量法测定DNA浓度，平均为259 ng/μL（范围：102–518）。一些提取物被多次使用（重复）以制备96孔板，每孔25 μL浓度为70 ng/μL的DNA。重复在后续下游分析中取平均值。

5.2 甲基化分析

使用Illumina MethylationEPIC Beadchip（Illumina Inc., California, USA）生成DNA甲基化数据。使用minfi R包中实现的“noob”归一化方法对甲基化数据进行归一化。技术重复的beta值在进一步分析前取平均值，为每个个体创建一个甲基化谱。CpG分为位于常染色体的CpG（n = 846,232）、位于X染色体的CpG（n = 19,090）和位于Y染色体的CpG（n = 537）。

5.3 表观遗传时钟

研究人员利用在线表观遗传时钟软件计算除DunedinPACE外的所有基于DNAm的生物标志物（可在https://dnamage.clockfoundation.org/calculator获取）。对于GrimAge时钟（这是一个包含性别的复合生物标志物），将所有样本的性别设置为女性，以确保在考虑多种非整倍性类型时结果一致。研究人员专注于九个生物学上相关的核型比较，包括：46,XX vs. 46,XY, 46,XY CAIS vs. 46,XY, 46,XY vs. 47,XYY, 46,XX vs. 47,XXY, 46,XY vs. 47,XXY, 46,XX vs. 46,XX SRY+, 46,XX vs. 47,XYY, 46,XX vs. 46,XY CAIS, 和 47,XYY vs. 47,XXY。

第一代时钟，如Horvath的泛组织时钟、Horvath等人的皮肤和血液时钟以及Hannum等人的血液时钟，主要衡量chronological age。相比之下，下一代时钟专注于评估死亡风险。例子包括Levine等人的DNAm PhenoAge和DNAm GrimAge。DNAm GrimAge是基于DNA甲基化（DNAm）的人类死亡风险的一个突出估计器。它是最公认的DNAm衰老生物标志物之一。还有估计端粒长度的时钟。“年龄加速”是通过取表观遗传衰老生物标志物的原始残差或预测年龄，并将其对chronological age进行回归来计算。

DunedinPACE是一种下一代表观遗传时钟，旨在测量衰老的 pace。它不是估计一个年龄，而是估计一个值，代表每chronological year的生物衰老年数，因此对于中年成年人，预期值约为1。

5.4 表观基因组关联研究（EWAS）

通过执行线性回归进行EWAS，其中CpG beta值对核型和样本年龄进行回归。研究人员进行了核型比较，其中每个核型编码为0或1：46,XX (0) vs. 47,XXY (1), 46,XY (0) vs. 47,XXY (1), 和 46,XY (0) vs. 47,XYY (1)。

5.5 基因组区域注释富集工具（GREAT）

使用rGREAT R包进行GREAT分析。GREAT使用前景和背景集执行超几何检验，并返回前景CpG附近基因集的注释。前景集总共包含4000个CpG，从核型EWAS比较中取 top 2000个最显著正相关和负相关的常染色体CpG。背景集包含EPIC阵列上的所有常染色体CpG。总共进行了18组GREAT分析，涉及九种不同比较以及每种比较的正相关和负相关CpG两组。所有报告的本体论均具有FDR调整后的超几何p值 < 0.05和未调整的超几何p值 < 0.001。使用的GREAT设置是hg19用于物种组装，近端：5.0 kb上游和1.0 kb下游，远端：50 kb。