健康与典型膳食模式的代谢组学特征解析：随机交叉试验揭示饮食质量评分与心脏代谢健康的生物标志物关联

本随机交叉喂养试验首次通过超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术，对比健康澳大利亚膳食（HAD）与典型澳大利亚膳食（TAD）的代谢响应，鉴定出65种区分性代谢物（31种血浆、34种尿液），并构建饮食质量生物标志物评分。该评分与收缩压/舒张压、LDL-胆固醇、甘油三酯和空腹血糖的改善显著相关，为基于澳大利亚膳食指南的客观饮食评估和心脏代谢风险早期监测提供了新工具。

　　

引言

膳食评估长期以来依赖自我报告方法，如食物频率问卷（FFQ）、饮食记录和24小时回顾。然而，代谢组学技术的进步使得能够同时测量生物样本中的数千种代谢物，包括尿液和血液。代谢物包括食物特异性外源性代谢物和反映食物代谢生物学效应的内源性合成代谢物，这推动了膳食代谢组学领域的出现，旨在识别生物样本中的代谢物以增强对人类饮食摄入代谢响应的理解。该方法有望提高膳食评估方法的准确性和可重复性，评估饮食干预方案的依从性和/或响应，检测个体响应差异，并生成关于特定饮食模式及相关健康影响的生物学机制的新知识。这些进展有可能为更精确的营养建议和个性化营养建议铺平道路。尽管潜力巨大，膳食代谢组学仍处于起步阶段，实际应用尚未完全实现。

最近的研究已经识别出几种潜在的候选饮食生物标志物，包括柑橘类水果消费相关的脯氨酸甜菜碱（stachydrine）以及与地中海或DASH饮食模式相关的代谢物。然而，饮食评估的生物标志物发现仍然具有挑战性，原因包括许多食物衍生代谢物的半衰期短、依赖自我报告的膳食评估方法以及高个体间变异性。此外，许多现有研究关注孤立食物而非饮食模式，限制了它们在评估习惯性饮食中的效用。

反映长期坚持特定饮食模式的生物标志物可能更有利于评估临床和公共卫生环境中饮食质量随时间的变化。然而，很少有代谢物通过提供所有食物的对照喂养研究进行评估，这种方法减少了异质性并确保了与特定饮食或食物关联的一致性量化。此外，缺乏使用这种对照喂养方法的随机交叉干预研究，尽管考虑个体内代谢变异性也很重要。例如，代谢物可以由微生物组和宿主遗传途径产生或影响，而交叉设计可以内在解释这些影响个体间和个体内变异的因素。我们的范围综述综合了旨在识别喂养干预后生物样本中代谢组的人类喂养研究的方法学组成部分。该综述发现，很少有膳食代谢组学研究检查国家特定的推荐或“更健康”饮食模式与人群通常或“不健康”饮食模式的比较，且尚未在澳大利亚进行。

当前研究通过进行一项随机交叉对照喂养试验来解决这些空白，比较符合当前澳大利亚膳食指南建议的健康澳大利亚饮食（HAD）和基于本研究开始时最新报告的明显消费数据的典型澳大利亚饮食（TAD）。本文的具体目标是：（i）描述在两种不同饮食模式下响应变化的血浆和尿液代谢物，同时明确考虑个体内变异性；（ii）识别HAD特有的区分性代谢物，并开发一个代谢组衍生的饮食质量评分，以评估其与心脏代谢健康标志物的关联。

实验部分

研究方法的详细描述已在他处发表，并根据DID-Metab清单进行报告。该试验在澳大利亚新西兰临床试验注册中心前瞻性注册。

伦理

本研究由Hunter New England人类研究伦理委员会（2022/ETH01649）和纽卡斯尔大学（UON）人类研究伦理委员会（H-2022-0330）批准。所有参与者在参与前提供书面知情同意。

招募

参与者从Hunter地区（澳大利亚新南威尔士州）招募，使用在大学校园公共空间广告的研究传单、媒体广告包括广播公告、Hunter医学研究所（HMRI）媒体发布、网络平台、志愿者登记册以及X（前Twitter）和Facebook等社交媒体平台，在2022年9月至2023年5月期间进行。志愿者通过完成在线REDCap调查评估资格，随后通过电话跟进澄清资格。个体如果满足概述的特征则符合资格。

志愿者如果有食物过敏或不耐受、未控制的高血压、1型糖尿病或胰岛素依赖型2型糖尿病、接受治疗的癌症、遵循严格饮食方案、胃肠道疾病史、消费已知影响研究结果和/或代谢的药物或补充剂、导入期不依从、怀孕或哺乳、或过量饮酒则不符合资格。目标样本量20人是根据我们类似交叉人类喂养研究的范围综述结果确定的。为评估研究是否足够检测次要和探索性结果的变化，进行了事后功率分析，使用每种饮食后的治疗后值。计算了受试者内差异（TAD-HAD），并使用这些差异的均值和标准差计算Cohen's d作为效应大小。使用R中的pwr包通过配对t检验估计功率。只有收缩压（约60%）和甘油三酯（约79%）的功率估计低于80%。所有其他结果超过90%功率，表明有很强的敏感性检测有意义差异。

实验设计

这是一项为期8周的随机交叉喂养试验，以2周导入期开始，参与者消费其通常饮食，随后是两个2周饮食干预期。两个干预期由2周洗脱期分隔，期间参与者回归消费其通常饮食。参与者使用计算机生成的区组随机化分配到每种饮食，按个人或夫妇入组分层。夫妇被一起随机化，以防止污染和保持依从性。每个干预期参与者收到的研究包根据分配由未参与数据收集的研究员顺序编号。由于研究设计（交叉）和需要为参与者安排食物交付，不可能对研究人员和参与者设盲。然而，饮食模式分配对参与者隐藏，以最小化偏倚和潜在污染。承认参与者可能猜测他们的饮食“更健康”或“较不健康”的周次。两种饮食均包含重复的7天菜单循环。提供足够食物以维持其导入期计算的习惯性能量摄入，确保干预期间体重稳定。

数据收集在纽卡斯尔大学营养与饮食学临床研究实验室亲自进行。问卷、血压、空腹血和点尿样本在整个研究的四个时间点收集，在每个干预期的开始和结束。每次访问时，参与者完成评估生活方式和健康相关因素的问卷，包括体力活动、药物使用和补充剂摄入，从而能够跟踪随时间的变化。指导参与者在整个研究中保持一致行为，并在每次研究访问前至少24小时避免剧烈运动和酒精。对于血压评估，参与者舒适就坐，腿不交叉，休息5分钟后使用Uscom BP+设备进行血压和动脉僵硬度测量。从左臂取三个读数，间隔1分钟；第一个丢弃，最后两个的平均值被使用。

饮食干预

HAD旨在满足符合国家饮食指南的五个核心食物组的推荐份量以及可接受的宏量营养素分布范围，包括膳食纤维、添加糖和钠目标。TAD基于2020-2021澳大利亚人表观消费报告数据建模。饮食干预提供所有每日餐食和零食，由研究团队设计，他们是认证执业营养师（APD）。所有食物从同一超市零售商采购，由研究团队订购，参与者从他们最近指定的超市收集。如果物品缺货，APD选择适当替代品以尽可能符合各自饮食干预的营养成分和食物组份量目标。在每个研究包中，参与者收到提醒卡和外出就餐资源，以确保任何额外消费的食物（研究和非研究食物）与分配到的饮食干预一致。参与者自备茶、咖啡和饮料，并指导使用Easy Diet Diary应用程序记录每个饮食阶段的饮料和非研究食物摄入。每种饮食中，提供了具有已知代谢物的关键指示食物。在HAD饮食中，优先每日消费与2,5-二羟基苯甲酸（gentisate）、3,5-二羟基苯丙酸（3,5-DHPPA）、3,5-二羟基苯甲酸（DHBA）和哌可酸甜菜碱相关的全谷物。TAD饮食包括每日消费巧克力（可可碱）。两种饮食均要求参与者每日消费橙汁，其中含有stachydrine（脯氨酸甜菜碱）。

使用澳大利亚饮食调查-心脏版（AES-Heart）评估基线饮食习惯，该工具已验证可测量3-6个月的通常饮食摄入。AES-Heart也在第2、4、6和8周重复，以确定其是否有效捕获短期（2周）摄入。此外，每周使用自动化自我管理24小时-澳大利亚（ASA24-AUS）饮食评估工具获取至少两次24小时饮食回忆，以在整个研究中监测依从性。其中一个强制回忆专门定时捕获尿液和血液样本收集前24小时的饮食摄入。两种饮食评估方法使用AUSNUT 2011-13食物和营养素数据库。参与者也由研究团队在每个干预期5-7天随机联系，以解决任何参与者关切并支持研究方案依从性。使用FoodWorks（专业版10；Xyris Software, Australia Pty Ltd）生成饮食摄入数据。

生物样本收集

参与者在至少8小时过夜空腹后参加亲自临床评估，并建议在之前24小时禁绝运动和酒精消费。合格静脉采血师通过静脉穿刺收集空腹血样本。试管送NSW病理学测量总胆固醇/HDL比率、LDL-胆固醇、HDL-胆固醇、甘油三酯和空腹葡萄糖。额外EDTA涂层管由研究团队保留，在4°C下3000 rpm离心15分钟。全血分成血浆、红细胞（RBCs）和血沉棕黄层等分。参与者自收集中段尿样本（非首次晨尿）于无菌容器，迅速置冰上并在收集后2小时内分装。分装后，血浆、RBC、血沉棕黄层和尿液样本在?80°C储存直至进一步分析。

代谢组学分析

血浆和尿液样本使用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法由Metabolon Inc.（Morrisville, USA）使用其全球发现面板分析。使用汇集实验样本进行血浆和尿液分析以生成相对标准偏差（RSD）值。尿液和血浆数据集的总体过程变异性通过计算所有内源性代谢物（即非仪器标准品）在100%客户矩阵样本中作为技术重复的汇集样本的中位RSD确定。血浆和尿液样本均在单一批次中处理，定义为运行日，最大容量每天144样本。在此运行日内，每种样本类型（尿液和血浆）分布在四个板上，每个板包含36、36、32和32样本，每个板有四个质量控制样本。血浆代谢物的中位RSD为8%，尿液为7%。血浆中总共识别1137代谢物，尿液样本识别1066代谢物。在通过用数据集中每个化合物的最小观测值插补处理缺失值后，数据进一步缩放至中位数为1，与Metabolon Inc.（Morrisville, USA）使用的标准处理程序一致。最小或半最小插补是非靶向质谱代谢组学中的常见方法，特别是当缺失假定由低于分析检测限的浓度引起时。

统计分析

所有代谢组数据在分析前进行对数转换。使用R中lme4包的线性混合效应（LME）模型评估干预组之间血浆和尿液代谢物的差异变化。每个模型，代表一种样本类型（尿液/血浆）的一种代谢物，包括受试者特定随机截距，并调整饮食组（HAD vs. TAD）、研究期（期1 vs. 期2）、饮食序列（HAD后TAD vs. TAD后HAD）、时间点测量（基线 vs. 饮食后2周）及其交互作用的固定效应。模型还调整年龄和性别作为协变量。这些调整解决了交叉设计中重复测量之间的潜在相关性。鉴于同一参与者样本缺乏独立性，受试者ID被视为随机变量。示例模型结构为：lmer(代谢物 ～ (饮食 + 期 + 序列) * 时间点 + 年龄 + 性别 + (1 | 受试者_id), data = 数据)。饮食 × 时间点交互项评估从基线到干预后的变化在两种饮食之间是否显著不同（即组间效应）。为估计每个饮食组内的干预效应，使用R中emmeans包计算估计边际均值（EMMs），及其标准误和p值。然后使用contrast()函数估计每个饮食组从基线到干预后的受试者内变化。为控制家族wise错误阳性率，在每个比较集内应用Benjamini-Hochberg（BH）校正，显著性阈值设为p < 0.05和q < 0.05。对于跨时间点和样本类型在两个饮食模式之间不同的持续代谢物，生成气泡图说明2周后血浆和尿液的相对代谢物变化幅度（EMM）和方向。

为识别可作为饮食依从性客观生物标志物的代谢物，应用弹性网络回归使用R中glmnet包。弹性网络是一种监督机器学习方法，结合L1（lasso）和L2（ridge）正则化以提高预测准确性和变量选择，特别是在高维数据中。使用cv.glmnet()与10折交叉验证识别最优惩罚参数（lambda）进行模型拟合。选择alpha值0.5以平衡lasso和ridge惩罚。模型训练以区分HAD与TAD，选择最有信息量的血浆和尿液代谢物。保留在最优lambda（lambda.min）下最终模型中非零系数的代谢物。然后使用这些系数构建复合饮食质量生物标志物评分：对于每个参与者在每个时间点，所选代谢物的浓度乘以其相应系数，加权值求和生成个体化评分，反映HAD依从程度。

然后评估该代谢组衍生的饮食质量评分与当前实践中使用的传统健康标志物的关联，使用LME模型与生化（甘油三酯、HDL-胆固醇、LDL-胆固醇、总胆固醇/HDL比率、空腹血浆葡萄糖）和临床结果（收缩压[SBP]、舒张压[DBP]）。为满足模型假设，评估每个模型的残差正态性。具有非正态分布残差的结果（SBP、LDL-胆固醇、甘油三酯）在建模前进行自然对数转换。所有模型调整年龄和性别作为固定效应，受试者ID作为随机效应，以解释重复测量和个体水平变异性。检查血压结果的模型额外调整抗高血压药物使用，而脂质模型调整降脂药物使用。

结果

在168名评估志愿者中，128名不符合资格标准。最终40名参与者入组，34名完成完整研究方案和所有研究措施（完成率=85%）。四名参与者在导入期退出 due to 时间约束（n=2）、开始抗生素（n=1）和无法获取主要结果评估血样（n=1）。其他两名在第一次喂养阶段退出，一名因开始长期抗生素（n=1）和不喜欢测试餐（n=1）。表2总结了完成所有研究措施的参与者特征。

代谢物在健康饮食和典型饮食内相对于各自基线不同

血浆

在调整多重比较后，观察到代谢物浓度的一致受试者内变化。2周后，遵循HAD和TAD饮食的参与者与其各自基线浓度相比，408种血浆代谢物表现出统计学显著差异。这些代谢物类别的大部分是脂质（46%；n=189），其次是氨基酸（21%；n=87）。具体地，70种代谢物在HAD后显著增加，包括gentisate（植物衍生酚类）、3-hydroxystachydrine（柑橘相关化合物）、N-ethyl beta-glucopyranoside（糖衍生物）和stachydrine（也称为脯氨酸甜菜碱，柑橘和一些草药中发现的化合物），而158种减少，包括可可碱（巧克力中发现的苦味生物碱）、咖啡因（咖啡和茶中发现的众所周知的兴奋剂）和3-methylxanthine（咖啡因代谢物）。相反，57种代谢物在TAD后减少，包括enterolactone sulfate（植物木脂素衍生的肠道微生物代谢物）、S-methylmethionine（蔬菜中发现的植物化学物质，有时称为“维生素U”）和S-methylcysteine sulfoxide（大蒜/洋葱中的硫化合物），而123种增加，包括3-hydroxystachydrine、N-methylproline（修饰的植物衍生氨基酸）、stachydrine和可可碱相对于其各自基线测量。

当比较TAD相对于HAD的总体变化差异时，247种代谢物显著不同，其中66种代谢物TAD后较低，其余181种代谢物TAD后较高。在那66种TAD后相对于HAD较低的代谢物中，大部分是氨基酸（44%，n=29）和脂质（24%，n=16）。相反，在181种显著增加的代谢物中，大部分是脂质（68%，n=123）和异生物质（14%，n=25）。

点尿

在调整多重比较后，参与者消费HAD和TAD饮食2周后，319种尿液代谢物浓度与其基线水平相比有显著变化。变化的主要代谢物类别是异生物质（38%；n=122）和氨基酸（28%；n=90）。HAD后，127种代谢物增加，类似血浆包括gentisate、stachydrine和3-hydroxystachydrine，但也包括N-methylhydroxyproline、N-methylglutamate（植物或微生物来源的甲基化氨基酸）、DHBA和3,5-DHPPA（膳食多酚肠道微生物代谢衍生的酚酸），而38种代谢物减少，如可可碱、betonicine（某些草药中发现的植物衍生甜菜碱）和3,7-dimethylurate（咖啡因分解产物）。TAD后，28种代谢物减少，如enterolactone sulfate（类似血浆）、betonicine和4-methoxyphenol sulfate（植物多酚代谢和II相解毒形成的硫酸化酚类化合物），而126种代谢物显著增加，包括可可碱、stachydrine（类似血浆）、3-hydroxystachydrine、N-methylglutamate和N-methylhydroxyproline相对于其各自基线测量。

当比较TAD相对于HAD的总体变化差异时，89种代谢物浓度显著不同，其中52种代谢物TAD后减少，其余37种代谢物TAD后较高。在那52种TAD后相对于HAD减少的代谢物中，大部分是氨基酸（46%，n=25）和异生物质（31%，n=17）。在37种增加的代谢物中，大部分是异生物质（57%，n=21）和氨基酸（16%，n=6）。

跨生物样本类型比较两种饮食时一致的代谢物

与基线测量相比，94种代谢物在两种生物流体类型中表现出一致和显著的组内变化（遵循TAD或HAD时），如表S1所示。值得注意的是，43种这些代谢物在比较相对组间变化（TAD vs. HAD）时也表现出跨样本类型（尿液和血浆）的显著差异，如图3所示。

代谢组衍生的饮食质量生物标志物评分的发展与心脏代谢结果相关

使用弹性网络回归，识别65种代谢物（31血浆，34尿液）作为区分HAD与TAD的关键特征，并随后用于构建复合生物标志物评分（图4A,B）。较高评分，反映更接近HAD依从性，与心脏代谢结果显著相关（图4C-H）。具体地，饮食生物标志物评分每增加一单位与DBP降低0.24 mmHg（β = ?0.242, p = 0.013）和SBP降低0.33%（β = ?0.0033对数尺度, p = 0.010）相关。较高评分也与显著较低空腹血浆葡萄糖水平（β = ?0.02 mmol/L, p < 0.001）、LDL-胆固醇（β = ?0.0138对数尺度, p < 0.001；约1.37%降低）、较低HDL-胆固醇（β = ?0.018 mmol/L, p < 0.001）和较低甘油三酯（β = ?0.0125对数尺度, p = 0.003；约1.24%降低）相关。与总胆固醇与HDL比率无显著关联（p = 0.82）。

讨论

在这项8周随机交叉喂养试验中，提供所有食物，观察到2周喂养健康