一种用于FLIM活细胞成像的荧光寿命分离方法

《Journal of Microscopy》：A fluorescence lifetime separation approach for FLIM live-cell imaging

荧光寿命成像（FLIM）通过荧光寿命作为额外对比维度，结合寿命分离技术，成功区分光谱重叠的mCherry和mKate2在线虫胚胎分裂动态追踪中，并去除了成虫肠道自主荧光干扰。开发的开源napari插件NFPP支持多格式FLIM数据处理、六维数据集转换及自动化分割，提升生物图像分析效率。

　　FLIM技术在生命科学研究中的应用正变得越来越重要，尤其是在生物样本的动态过程分析方面。该技术通过将荧光物质在激发后的寿命信息转化为图像中的对比度，从而实现对荧光信号的分离和识别。这种能力在处理具有高度光谱重叠的荧光物质时尤为关键，因为它允许研究人员区分在传统光谱分析中难以区分的分子信号。本文通过使用开源软件，展示了FLIM相位分析（phasor analysis）在活细胞成像中的应用，特别是在秀丽隐杆线虫（*Caenorhabditis elegans*）胚胎和成虫中的实验。这项研究不仅为理解生物分子之间的复杂相互作用提供了新的视角，也为生物图像数据的管理与分析带来了技术上的进步。

在传统荧光显微镜技术中，由于光谱重叠和实验设备的限制，研究人员往往难以同时追踪多个生物分子。而FLIM技术则通过测量荧光寿命，提供了一种独立于光谱信息的分析方式。荧光寿命是荧光物质在被激发后处于激发态的时间长度，它在微环境中是每个荧光物质的独特属性。这种寿命信息可以作为图像处理的依据，帮助研究人员对像素或对象进行分类。然而，FLIM技术的一个主要挑战在于，为了获得准确的寿命衰减曲线，通常需要较高的光子数量，这可能会影响图像的采集速度和空间分辨率。

为了解决这些问题，研究人员开发了多种软件工具，包括FLIMfit、FLIMJ、PAM、FLUTE、PhasorIdentifier、napari-live-flim、napari-phasors、phasorpy、GSLab和FLIMPA等。这些工具各具特色，有的适用于寿命拟合分析，有的则基于相位分析方法。其中，基于相位分析的工具因其用户友好性和可视化能力，正逐渐受到更多关注。相位分析通过将衰减数据转换为二维（2D）图谱，可以直观地显示每个像素的寿命特性，而无需研究人员预先假设样本中的寿命组分数量。这种技术使得研究人员能够快速识别具有相似生物内容的像素点，并将其归类为一个整体进行进一步分析。

在本文中，研究人员开发了一种新的开源插件——napari-flim-phasor-plotter（NFPP），用于可视化和分析高维FLIM数据集。NFPP插件能够处理多种格式的原始FLIM数据，包括PTU和SDT格式，并将其转换为更易处理的ZARR格式。ZARR是一种分块存储格式，允许研究人员在处理大规模数据时，实现“懒加载”（lazy loading），从而提升处理速度和效率。此外，NFPP还支持将数据集转换为OME-TIFF格式，以便上传至OMERO平台进行共享和进一步分析。

为了更好地展示FLIM技术的应用，本文通过两个具体实验案例说明了其在区分荧光物质和去除自然自荧光方面的潜力。第一个案例是使用NFPP对秀丽隐杆线虫胚胎中的mCherry和mKate2进行寿命分离，这两种荧光物质在光谱上高度重叠，但它们的寿命特性不同。通过生成相位图（phasor plot），研究人员能够识别出对应的寿命簇，并利用这些信息对荧光信号进行分离，从而在多通道图像中实现对特定结构的跟踪。第二个案例则是去除成虫中肠道的自荧光信号，使得研究人员能够更清晰地观察与之相邻的组织，如生殖腺。在这些案例中，寿命分离不仅提高了图像的清晰度，还为后续的定量分析提供了更可靠的数据基础。

此外，本文还探讨了FLIM数据的处理与存储问题。由于不同FLIM数据格式（如LIF、PTU、SDT）的使用，使得数据在处理和共享时面临诸多挑战。现有的工具虽然支持部分格式，但在处理高维数据（如6D）时仍显不足。NFPP插件的引入，使得研究人员能够更灵活地处理这些数据，并将其整合到开源图像分析平台napari中。同时，该插件还支持将数据转换为更通用的格式，如ZARR和OME-TIFF，以便在OMERO等生物图像管理平台上进行可视化和分析。

本文的实验设计涵盖了从数据采集、处理到分析的完整流程。在数据采集阶段，研究人员使用了共聚焦激光扫描显微镜（STELLARIS 8，Leica Microsystems）和脉冲超连续谱激光器（NKT Photonics），在特定的光谱范围内对荧光物质进行激发，并记录其发射光谱。对于高维数据，研究人员选择了40x/1.1水浸式物镜，确保足够的空间分辨率，同时使用了较高的光子计数来减少噪声对寿命计算的影响。在数据处理阶段，NFPP插件对原始数据进行转换和分析，生成相位图，并通过交互式分割功能将不同的寿命簇提取出来。随后，研究人员对这些数据进行了进一步的处理，包括使用滤波算法去除噪声、连接相邻对象，并计算染色体和纺锤体的中心位置，从而追踪其动态变化。

在分析结果方面，研究人员利用寿命分离技术，成功区分了不同荧光物质的信号，并对其动态行为进行了定量分析。例如，在胚胎细胞分裂过程中，通过计算染色体之间的欧几里得距离和纺锤体之间的极到极距离，研究人员能够估计细胞分裂的速度。这些数据不仅验证了寿命分离技术的准确性，也为进一步研究细胞分裂机制提供了重要的实验依据。此外，在去除自荧光的实验中，研究人员发现通过寿命分离，能够显著提高生物分子的定位精度，从而增强科研成果的质量。

从技术角度来看，本文的贡献在于提供了一种高效、开放的解决方案，以应对当前FLIM数据处理和分析中的挑战。NFPP插件的开发，使得研究人员能够更方便地处理和分析多维FLIM数据，而无需依赖特定的商业软件。这种开源工具不仅提高了数据的可访问性和可重用性，还促进了科研数据的标准化和共享。此外，研究人员还探讨了如何将FLIM数据与现有的生物图像管理平台（如OMERO）结合，以实现更高效的图像存储、共享和分析。通过将6D数据转换为5D格式，并结合ZARR的分块存储特性，研究人员能够更灵活地管理大规模数据集，并在云平台中进行快速处理。

总体而言，本文不仅展示了FLIM技术在生命科学研究中的强大功能，还通过开发新的开源工具，推动了该技术在高维数据处理和分析方面的应用。研究人员强调，FLIM技术的进一步发展需要更多的社区支持和标准化数据格式的推广。随着生物图像数据的不断增长，如何高效地处理和分析这些数据，将成为科研界关注的重点。NFPP插件的出现，为这一目标提供了有力的技术支持，同时也为未来的科研工作奠定了坚实的基础。