丹麦2022–2023年圈养鸽高致死性鸽副粘病毒1型（PPMV-1）两次暴发：病毒学特征、病理学与分子流行病学研究

本研究首次报道了丹麦自2005年以来由鸽源禽副粘病毒1型（PPMV-1）引起的两次高致死性疫情，详细描述了其病毒学特征、病理变化及分子进化关系。研究分离株分别属于基因型VI.2.1.1.2.2和XXI.1.1，均具有多碱性裂解位点（分别为112RRQKRF117和112KRQKRF117），但体内外致病性试验结果存在差异。研究强调了野生鸟类（尤其是野鸽）作为病毒潜在储存库的风险，并为鸽群监测和跨物种传播预警提供了重要科学依据。

　　

1. 引言

禽副粘病毒1型（APMV-1）属于副粘病毒科正禽腮腺炎病毒属，可感染200多种鸟类，其临床结局从亚临床感染到高致死性全身性疾病不等。强毒株是新城疫（ND）的病原体，对家禽业造成严重经济损失。根据基因组长度和融合蛋白（F）基因序列，APMV-1可分为两类：Class I（仅含一个基因型）和Class II（包含21个基因型，I–XXI）。从鸽形目（鸽和鸠）分离的毒株主要属于基因型VI和XXI，被称为鸽副粘病毒1型（PPMV-1）。PPMV-1于1970年代在中东的赛鸽中首次出现，自1980年代以来已在全球传播，目前在包括欧洲在内的许多地区呈地方性流行。尽管偶尔会传播给家禽，但在鸡群中的暴发通常是散发的。

APMV-1毒株可通过鸡胚平均死亡时间（MDT）试验和脑内致病性指数（ICPI）试验进行生物学分型，分为弱毒力（lentogenic）、中等毒力（mesogenic）或强毒力（velogenic）。此外，也可基于F蛋白裂解位点的核苷酸序列进行分子分型。强毒株具有多碱性裂解位点，可被普遍存在的蛋白酶切割，导致全身性感染；而无毒力株具有单碱性裂解位点，只能被细胞外蛋白酶切割，将感染限制在呼吸道和消化道。根据世界动物卫生组织（WOAH）标准，具有多碱性裂解位点或ICPI评分高于0.7的APMV-1被归类为强毒株，通常被称为新城疫病毒（NDV）。

在丹麦，新城疫是法定报告疾病，自2004年起强制要求对鸡进行疫苗接种。上一次疫情发生在2005年，发生在尚未接种疫苗的鸡群中。对于鸽子，仅在特定情况下（如某些比赛和展览）才需要接种疫苗。2022年和2023年，丹麦经历了自2005年以来的首次APMV-1疫情，均由PPMV-1引起，发生在饲养大量鸟类（包括鸽和鸡）的丹麦农庄社区。

2. 材料与方法

2.1. 病例描述与采样（2022年6月疫情）

2022年5月31日，一名兽医向丹麦兽医和食品管理局（DVFA）报告，怀疑在丹麦东南部N?stved附近的Stenb?ksholm和Stenstrup的一个农庄社区发生新城疫（ND）、禽流感（AI）或鹦鹉热（鸟疫，由鹦鹉热衣原体引起）。该社区有23个业主，饲养1053只鸟类，包括851只鸽子、170只鸡、14只金丝雀、9只斑胸草雀、7只鸡尾鹦鹉和2只鹦鹉。鸽子包括观赏鸽和赛鸽。疾病主要影响鸽子，临床体征包括震颤、斜颈等神经症状、面部肿胀、厌食、产蛋下降、薄壳蛋、腹泻和死亡率升高。鸡仅表现为孵化期延长和出雏时死亡。死亡率在鸽子中差异很大（25%–100%），幼鸽死亡率最高。一些业主报告没有临床体征和死亡，表明并非所有农庄都受到影响。鸽群的PPMV-1疫苗接种覆盖率因饲养实践而异，但疾病主要发生在未接种疫苗的鸽子中。

为调查疫情，从活鸽和死鸽采集了口咽和泄殖腔拭子池，用于APMV-1和AIV检测，另采集拭子用于鹦鹉热衣原体检测。2022年6月2日，DVFA宣布发生强毒APMV-1疫情。疫情确认后，从四个农庄收集了9只死鸽、1只扑杀鸽和1只扑杀鸡进行病理学、组织病理学和免疫组织化学（IHC）检查。由于Stenb?ksholm农庄社区与Stenstrup的私人住所距离很近，两者被作为一个流行病学单位处理。所有鸟类均被扑杀，并对场所进行消毒，同时建立了3公里保护区和10公里监测区。

2.2. 病例描述与采样（2023年6月疫情）

2023年6月，在丹麦西北部奥尔堡的一个农庄社区发生了第二次疫情。该社区有37个业主，饲养1896只鸟类，包括40只鸽子，以及观赏鸡和各种其他观赏鸟（如金丝雀和鹦鹉）。与2022年疫情不同，此次疫情中只有鸽子受到影响，40只鸽子中有30只死亡。患病鸽子表现出与2022年疫情一致的临床体征，包括神经症状、厌食、产蛋下降、薄壳蛋、腹泻和死亡率升高。鸟类的疫苗接种情况未知。

为调查疫情，从鸽子采集了口咽和泄殖腔拭子池用于AI和NDV分析。此外，提交了2只死鸽进行检测。疫情确认为强毒APMV-1后，所有鸟类被扑杀，场所进行消毒，并实施了保护措施，包括建立3公里保护区和10公里监测区。

2.3. 大体病理学、组织病理学和免疫组织化学

对鸽和鸡进行了系统的大体检查。组织样本用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm切片用苏木精和伊红（H&E）染色进行组织病理学检查，连续切片用鼠抗NDV核蛋白（NP）单克隆抗体Q50进行IHC染色。IHC标记采用半定量评分系统评估：0= absent, 1= rare, 2= low numbers, 3= moderate numbers, 4= abundant (coalescing to diffuse) immunolabelled cells。

2.4. 病原检测

样本检测遵循欧洲禽流感和新城疫参考实验室（EURL）的建议。拭子用病毒运输培养基收集，组织样本用Buffer RLT加1% β-巯基乙醇匀浆，RNA用RNeasy Mini Kit在QIAcube上提取。APMV-1检测采用靶向L蛋白和M蛋白的rRT-PCR assays。毒力判定通过F基因RT-PCR和Sanger测序进行，根据WOAH手册评估为强毒或弱毒。AIV检测采用靶向基质蛋白和血凝素基因的rRT-PCR assays。2022年疫情样本还筛查了鹦鹉热衣原体。

2.5. 病毒分离

口咽和泄殖腔拭子材料经0.45 μm滤膜过滤后，接种9–11日龄无特定病原体（SPF）鸡胚尿囊腔，37°C孵育最多6天，每日照蛋。所有分离株传代两次，收获的尿囊液通过快速血凝（HA）试验检测血凝活性。

2.6. 血凝抑制（HI）试验

收获的尿囊液用WOAH方案进行HI试验，使用4个HA单位的病毒，以及APMV-1基因型II（LaSota）和PPMV-1基因型VI.1参考多克隆抗血清，以及单克隆抗体U85、161/617和7D4。检测了11只鸽子的血液对分离株和参考抗原的HI抗体滴度，滴度高于8视为阳性。

2.7. MDT和ICPI试验

通过MDT试验测定病毒致病性。将病毒10倍稀释系列接种9日龄SPF鸡胚，每稀释度5个胚，观察7天，记录死亡时间。MDT<60小时为强毒，60–90小时为中毒，>90小时为弱毒。2022年分离株还通过ICPI试验测定致病性，将病毒稀释液脑内接种10日龄SPF鸡，观察8天，根据发病情况评分。ICPI<0.7为弱毒，0.7–1.5为中毒，>1.5为强毒。

2.8. F基因测序与系统发育分析

用RT-PCR扩增完整F基因，使用Illumina MiSeq系统测序。序列用CLC Genomics Workbench处理。进行系统发育分析，与Class II基因型参考序列以及通过BLAST识别的最佳匹配序列进行比对。用IQ-TREE进行最大似然分析（1000次bootstrap重复），使用GTR+G+I模型。用FigTree可视化。计算分离株与其近缘株之间的配对核苷酸距离以评估遗传相关性。

2.9. 全基因组测序与生物信息学分析

采用下一代测序（NGS）宏基因组学方法对两个疫情分离株进行全基因组测序。RNA提取后转换为cDNA，片段化，构建文库，在Ion Torrent S5 XL系统上测序。 reads用RIEMS进行 taxonomic binning，Diamond blastx进行APMV-1识别，Newbler进行组装和 mapping。完整编码序列（CDS）已上传至GenBank数据库，2022年病毒命名为PPMV-1/pigeon/Denmark/04977-10/2022（登录号PV260999），2023年病毒命名为PPMV-1/pigeon/Denmark/05038-4/2023（登录号PV261000）。

2.10. 氨基酸变化与宿主适应性分析

分析了与毒力、抗原位点和宿主适应性相关的氨基酸变化，纳入了先前多个研究报道的变化，并包括了Huang等人和Dortmans等人鉴定的宿主特异性位点，以研究对鸡的潜在适应性。

3. 结果

3.1. 2022年6月疫情

3.1.1. 病原检测

从农庄社区鸽子采集的10个拭子池中，8个检测到APMV-1。测序确认了多碱性F蛋白裂解位点，将病毒归类为强毒株。20个拭子池中的2个检测到鹦鹉热衣原体。未检测到AIV。从11只鸽子采集的血液样本中，3只检测到APMV-1抗体。从活鸽和死鸽的拭子池中成功分离到APMV-1，其中一个分离株（来自死鸽泄殖腔拭子池）命名为PPMV-1/pigeon/Denmark/04977-10/2022，用于进一步病毒学表征。

3.1.2. 大体病理学

对10只鸽子和1只鸡进行剖检。鸽子（6雌4雄）均为成年，体况差（1只）或极差（9只）。羽毛一般无异常，但5只鸽子泄殖腔周围有粪便污染。3只鸽子出现眼周充血和水肿。7只鸽子出现肺充血，偶伴出血，1只鸽子肺内可见多个淡黄色病灶（脓肿/坏死）。9只鸽子肝脏充血，1只肝实质可见少量黄白色病灶。肾脏肿胀、苍白、易碎。腺胃和肌胃食物少，肠内容物稀疏。其他器官（包括脑和心脏）无异常。鸡无大体病变。

3.1.3. 组织病理学与IHC

对10只鸽子和1只鸡的多个组织进行了组织病理学和病毒IHC评估。在鸽子中，病变最常见于脑，所有10只鸽子均出现轻微至轻度、多灶性、非化脓性脑炎，表现为神经胶质增生、偶发神经元变性和轻度单核细胞血管周围套袖现象。1只鸟还出现脑膜炎。在8只鸟的脑内检测到少量病毒抗原，主要在内皮细胞，也在室管膜细胞、脉络丛上皮和少数神经元中。在出现脑膜炎的鸟中，抗原存在于小脑周围的脑膜、Virchow–Robins间隙、脑膜细胞和血管内皮中。

在肾脏，8只鸟出现中度多灶性淋巴细胞浆细胞性肾小管间质性肾炎。在7只伴有病变和2只无病变的鸟中检测到大量病毒抗原，主要位于肾小管上皮细胞和管腔内细胞碎片中，以及间质内皮中。另1只鸟出现轻度多灶性慢性活动性间质性肾炎伴轻度多灶性淋巴样增生，但未检测到抗原。

在肺，6只鸟出现弥漫性肺充血，2只出现轻度淋巴细胞性支气管炎，4只出现脓肉芽肿性肺炎伴病灶内细菌菌落和真菌菌丝。在8只鸟的肺中经常在无病变的情况下发现病毒抗原，位于内皮、支气管上皮，偶见于成纤维细胞和巨噬细胞中。在气管，1只鸟出现轻度多灶性淋巴细胞性气管炎，病毒抗原共定位于内皮和上皮。在心脏，5只鸟出现轻微、局灶至多灶性淋巴细胞性心外膜炎，在4只鸟的心外膜和内皮中观察到少量病毒抗原，偶见于心肌（1只鸟）。此外，1只鸟出现显著多灶性急性纤维蛋白坏死性心肌炎和心外膜炎，但无相关免疫标记。

胰腺中，3只鸟出现外分泌胰腺坏死，3只出现轻微至中度多灶性单核细胞性胰腺炎。在7只鸟的腺泡上皮和间质内皮中检测到病毒抗原，通常（5/7）但不总是（2/7）与组织病理学病变相关。在肝脏，存在可变病变，但病毒抗原阳性（5/10）的鸟表现为无明显病变（1/5）、轻度多灶性肝细胞变性（2/5）或中度多灶性单核细胞性肝炎（1/5）。病毒抗原主要在内皮、Kupffer细胞和偶在肝细胞中检测到。其中1只鸟出现严重多灶性脓肉芽肿性肝炎（与病灶内线虫相关）和中度至重度弥漫性慢性淋巴细胞浆细胞性胆管炎。该病例中，在脓肉芽肿病变周围包裹的成纤维细胞和内皮中检测到大量病毒抗原。其他非特异性发现包括轻度多灶性淋巴细胞性肝炎和髓外造血（4/10）。

腺胃仅从1只鸟获得检查，出现局灶性腺体扩张伴上皮变薄和大量管腔内蛋白性渗出物，病毒抗原共定位于腺体上皮和内皮。在小肠，6只鸟常出现轻度弥漫性淋巴细胞浆细胞性肠炎，1只鸟出现节段性纤维蛋白坏死性浆膜炎，1只鸟有肠道线虫病，2只鸟无病变。在4只鸟的内皮和成纤维细胞中，偶在浆膜中检测到病毒抗原，大多与组织学病变无关。

从3只鸟检查卵巢，未见组织病理学变化，但所有3只鸟的内皮、皮质基质和卵巢表面上皮中弥漫存在大量标记，1只鸟的退化卵泡生发上皮中也存在抗原。检查了1只鸟的输卵管，出现轻度多灶性单核细胞性输卵管炎和体腔炎。在内皮、管状上皮和平滑肌细胞中检测到大量抗原。

在所检查的鸡中，观察到非特异性组织学病变，包括脓肉芽肿性肺炎、轻微局灶性心外膜炎、轻微多灶性淋巴细胞性肝炎伴髓外造血、轻微弥漫性淋巴细胞浆细胞性肠炎和多灶性淋巴细胞性浆膜炎，以及淋巴样增生。在所有检查组织中未检测到病毒抗原。

3.1.4. rRT-PCR组织分布

对剖检鸽子组织的APMV-1 rRT-PCR分析显示，所有10只鸽子均存在全身性病毒分布，与在所有检查组织中检测到APMV-1抗原一致。剖检鸡的所有采集组织APMV-1均为阴性，IHC结果也支持无感染。所有组织AIV均为阴性。未对组织进行鹦鹉热衣原体检测，但2只剖检鸽的泄殖腔拭子呈阳性。

3.1.5. 病毒学与系统发育表征

对分离株P/DK/04977-10/2022的F基因测序和系统发育分析显示，该病毒属于Class II基因型VI.2.1.1.2.2，归类为PPMV-1。这与HI试验中与单克隆抗体161/617的反应一致。完整F基因系统发育分析显示，P/DK/04977-10/2022与最近在瑞士、澳大利亚和南非分离的病毒密切相关。最接近的亲戚是瑞士的三个分离株，平均核苷酸距离为0.03%，表明当前分离株最近从一个共同祖先病毒分化而来。分子和体内分型结果不一致：分子分型显示多碱性裂解位点¹¹²RRQKRF¹¹⁷，表明是强毒株；MDT为82.8小时，表明是中等毒力；而ICPI评分为0.65，将其归类为弱毒力。

全基因组测序（WGS）为P/DK/04977-10/2022生成了15,174 nt的一致序列。具有NP基因5'非编码区6-nt插入的Class II APMV-1基因组长度为15,192 nt。由于P/DK/04977-10/2022的NP基因中含有此插入，因此确定其完整基因组长度为15,192 nt。缺少的18 nt来自未测序的5' trailer区。

对抗原位点和与毒力及宿主适应性相关的氨基酸位置的分析显示，在与毒力降低相关的残基上没有显著替换。在HN基因中鉴定出一个与疫苗逃逸相关的替换E347G。此外，检测到一个指示宿主适应鸡的替换：P/DK/04977-10/2022在NP基因431位显示丝氨酸（S），而与92.25%的鸽源基因型VI病毒中发现的脯氨酸（P）相反。该替换与大多数鸡源病毒一致，其中87.5%的基因型XX和98.11%的基因型VII病毒在该位置为丝氨酸。

3.2. 2023年6月疫情

3.2.1. 病原检测

从死鸽、临床病鸽和外观健康鸽采集的所有口咽和泄殖腔拭子中，除一池临床病鸽的泄殖腔拭子外，均检测到APMV-1。F基因测序显示强毒F蛋白裂解位点。所有拭子池均未检测到AIV。从临床病鸽的口咽拭子池和死鸽的泄殖腔拭子池中成功分离到APMV-1。从临床病鸽口咽拭子池分离的病毒命名为PPMV-1/pigeon/Denmark/05038-4/2023，用于进一步病毒学表征。

3.2.2. 大体病理学

对疫情中的2只鸽子（1只年轻雄鸽和1只成年雌鸽）进行剖检。两者体况极差，羽毛蓬乱脏污。雄鸽出现肺出血和实变，成年雌鸽出现肝充血和胰腺出血。其他器官无异常。由于与病鸽密切接触，还对10只鸡进行剖检。其总体状况、包括羽毛、体况和器官均无异常，仅2只鸡羽毛蓬乱。

3.2.3. 组织病理学与IHC

对2只剖检鸽进行了组织病理学和病毒IHC评估，但组织学解释受限于严重自溶和仅采集了少量组织。在1只鸽的脑中，观察到轻度多灶性非化脓性脑炎伴轻度淋巴细胞血管周围套袖现象，抗原共定位于神经元和内皮。在肺中，1只鸟出现弥漫性肺充血，在内皮、平滑肌和偶见巨噬细胞中检测到大量病毒抗原；另1只鸟无组织学变化，但内皮中有中等量病毒抗原。两只鸟的气管均未发现病变，但1只鸟的内皮和粘膜上皮中存在少量标记。从1只鸽采集的小肠因自溶无法进行显微镜评估，但肠壁平滑肌和内皮中可见病毒抗原。

3.2.4. rRT-PCR组织分布

从剖检鸽采集的所有组织APMV-1 rRT-PCR均为阳性，符合全身性分布，这得到IHC在1只鸽脑中检测到抗原的进一步支持。相比之下，在剖检鸡的口咽和泄殖腔拭子或组织中未检测到APMV-1。

3.2.5. 病毒学与系统发育表征

对分离株P/DK/05038-4/2023的F基因遗传和系统发育分析显示，该病毒属于Class II基因型XXI.1.1，归类为PPMV-1。完整F基因系统发育分析显示，2023年疫情病毒与来自伊朗、迪拜、埃及和巴基斯坦的病毒密切相关。与P/DK/05038-4/2023最接近的是伊朗的一个分离株，核苷酸距离仅为0.02%。裂解位点为多碱性，基序为¹¹²KRQKRF¹¹⁷，指示强毒力型。MDT为72小时，指示中等毒力。未进行ICPI试验。2022年和2023年疫情病毒的遗传和致病特性总结于表2。

使用APMV-1（LaSota）和PPMV-1抗血清进行HI试验，HI滴度分别为128和16。使用单克隆抗体U85、161/617和7D4的HI试验均为阴性。

P/DK/05038-4/2023的WGS产生了15,192 nt的序列，包含所有6个基因的完整编码序列。有趣的是，F基因的起始密码子被鉴定为ACG，而非典型的ATG。这一发现通过WGS和靶向F基因测序（独立进行）均得到确认。只有F基因表现出这种不寻常的起始密码子。

对P/DK/05038-4/2023的抗原位点以及与毒力和宿主适应性相关的氨基酸位置进行的WGS分析显示，没有发现与毒力降低相关的显著替换。然而，在F基因中鉴定出两个指示适应鸡的替换：I50V和H259Q。通常，基因型VI鸽源病毒在50位为异亮氨酸（I），259位为组氨酸（H）。此外，在HN基因中鉴定出三个指示毒力增强的替换：N263K、V266A和I514V。253和514位位于HN基因的中和表位，与中和疫苗逃逸变异相关。266位据报道在HN基因中受到正选择，位于潜在的B细胞表位。

4. 讨论

本研究描述了丹麦发生的两次独立的PPMV-1疫情。2022年6月，疫情发生在丹麦东南部Stenb?ksholm和Stenstrup，涉及基因型VI.2.1.1.2.2 PPMV-1（P/DK/04977-10/2022）。一年后，2023年6月，另一场疫情发生在丹麦西北部奥尔堡，涉及基因型XXI.1.1 PPMV-1（P/DK/05038-4/2023）。时间、地区和基因型的分离证明这些疫情无关，并表明丹麦存在不同的鸽特异性基因型。

两次疫情中，临床体征与PPMV-1感染一致，包括高死亡率和一些鸽子的严重神经症状，而其他鸽子表现出轻度抑郁。2022年疫情影响了851只鸽子，死亡率可变（25%–100%），而2023年疫情涉及40只鸽子，导致30死亡。在鸡中，2022年观察到轻微的临床体征，如孵化时间延长和胚胎死亡，但2023年疫情没有报告鸡的临床体征。2023年疫情剖检的10只鸡没有出现与APMV-1感染一致的病理变化或检测到APMV-1，表明其死亡与APMV-1无关。2022年疫情的鸽子据称已患病较长时间（数周至数月），一些鸟恢复后再次出现临床体征。然而，仅11只采血鸽子中的3只检测到APMV-1抗体，这表明鸽子可能并非长期感染APMV-1。此外，存在并发或继发细菌和真菌感染，这使基于临床体征和病理学评估病毒毒力变得复杂。

尽管一些鸟存在继发感染，但一致的临床表现、特征性病理发现以及病毒原位与多器官系统炎症的串联关联，特别是频繁的病毒相关性非化脓性脑炎，强烈支持PPMV-1是鸟类死亡的主要病原体。虽然继发感染可能 contributed to morbidity，但它们不太可能解释暴发模式和高死亡率。尽管通过实验感染研究鸽子可以满足科赫法则，但这种方法受到伦理和实践限制。因此，这些疫情中的因果关系是从病理学和病毒学发现的一致汇合中推断出来的。

两次疫情鸽子的显微镜分析显示了系统性的病毒抗原分布和多种细胞嗜性，包括神经元和血管内皮。2022年疫情中，非化脓性脑膜脑炎和肾小管间质性肾炎是最常见的发现，而2023年疫情（尽管仅限于2只鸽子）包括1例病毒相关性脑炎。这些微观病变与其他地方报道的与致病性PPMV-1相关的自然疾病暴发相似。此外，2022年疫情在生殖组织中检测到病毒抗原，表明与疫情期间观察到的产蛋受损和薄壳蛋存在潜在关系。总体而言，病毒抗原的持续系统性存在，结合引起高发病率和高死亡率的急性疾病，证明了本研究中圈养鸽的PPMV-1具有强毒表型。

APMV-1是一种人畜共患病原体，偶尔在人类中引起轻度结膜炎。然而，有报道称免疫抑制个体感染PPMV-1导致死亡病例。这些病例突出了与鸽子密切接触和 handling 相关的风险，特别是对于免疫抑制个体，并表明在经常 handling 鸽群的环境（如本研究中受影响的农庄社区）中，对鸽子进行PPMV-1筛查和疫苗接种可能有益。

P/DK/04977-10/2022和P/DK/05038-4/2023均被归类为PPMV-1，因为它们属于鸽相关基因型VI和XXI，从鸽子中分离，并且通过主要在该宿主引起疾病表现出明显的宿主适应性。它们针对常用于区分PPMV-1和APMV-1的单克隆抗体161/617进行了测试。然而，P/DK/05038-4/2023不与该抗体反应，也不与其他通常与非鸽APMV-1毒株反应的单克隆抗体（如7D4和U85）反应。先前已有PPMV-1毒株未能与161/617单克隆抗体反应的报道。鉴于基因型XXI从基因型VI进化而来，且161/617是基于基因型VI开发的，这种缺乏反应性可能反映了这种进化分化产生的抗原变化。

F蛋白裂解位点是APMV-1致病性的关键决定因素，在两个病毒之间有所不同。P/DK/04977-10/2022具有¹¹²RRQKRF¹¹⁷