真菌效应蛋白Aa593劫持CmNAC29介导的ABA生物合成通路增强菊花对链格孢易感性的机制研究

本研究揭示了链格孢真菌(Alternaria alternata)通过分泌效应蛋白Aa593靶向菊花转录因子CmNAC29，进而激活ABA生物合成关键基因CmNCED3的表达，从而削弱植物免疫防御的新机制。该发现不仅阐明了坏死营养型真菌通过操纵植物激素信号通路增强毒力的进化策略，更为菊花黑斑病的防控提供了重要理论依据和潜在分子靶标。

　　

植物与病原体间的相互作用一直是植物免疫学研究的热点领域。本研究通过系统解析菊花与链格孢真菌(Alternaria alternata)互作过程中的关键分子事件，发现了一个由Aa593/CmNAC29-CmNCED3组成的病原侵染调控模块。

CmNAC29作为负调控因子增强植物易感性

通过RNA-seq数据分析，研究团队从菊花'金霸'品种中鉴定到一个受链格孢侵染显著诱导的转录因子基因CmNAC29。该基因编码的蛋白N端9-134位氨基酸包含典型的NAM结构域，C端135-283位氨基酸具有转录激活活性，且定位于细胞核内。实时荧光定量PCR分析显示，CmNAC29在链格孢侵染过程中持续高表达，在根和叶片组织中表达水平较高。

为明确CmNAC29的功能，研究人员构建了amiR-CmNAC29干扰系菊花植株。接种实验表明，与野生型相比，干扰系植株病情发展显著减缓，病斑面积明显减小，证明CmNAC29作为负调控因子通过增强植物对链格孢的易感性而发挥作用。

CmNAC29直接激活CmNCED3转录促进ABA生物合成

通过比较野生型和amiR-CmNAC29干扰系植株的转录组数据，研究发现"信号转导机制"和"次生代谢物生物合成、运输和分解代谢"通路显著富集。KEGG分析进一步表明差异表达基因与"植物激素信号转导"和"类胡萝卜素生物合成"通路相关。

值得注意的是，类胡萝卜素生物合成中间体是脱落酸(ABA)合成的前体，而拟南芥中CmNAC29的同源蛋白NAP/ANAC029已被报道参与ABA生物合成。实验证实，与野生型相比，干扰系植株中多个ABA合成通路基因(CmABA4、CmNCED3、CmNCED5、CmABA2、CmAAO3和CmABA3)表达显著下调，其中CmNCED3差异最显著。

酵母单杂交(Y1H)和电泳迁移率变动分析(EMSA)表明，CmNAC29直接结合CmNCED3启动子区的"CACG"顺式作用元件。染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR进一步验证CmNAC29特异性富集在包含"CACG"元件的CmNCED3启动子区段。双荧光素酶报告基因试验显示，CmNAC29的存在显著提高了荧光素酶/海肾荧光素酶(LUC/REN)比值，证实CmNAC29直接激活CmNCED3转录。

激素水平检测发现，无论是在接种前还是接种后，amiR-CmNAC29系植株的ABA含量均显著低于野生型，而过表达CmNAC29系植株则呈现相反趋势。通过病毒诱导基因沉默(VIGS)技术获得CaLCuV-amiR-CmNCED3植株，这些植株表现出对链格孢增强的抗病性。

外源ABA处理实验表明，ABA能够补偿amiR-CmNAC29植株丧失的易感性，CmNAC29介导的对链格孢敏感性依赖于ABA。这些结果共同证明，ABA促进链格孢在菊花中的侵染，而CmNAC29通过直接激活CmNCED3表达增强植物体内ABA生物合成。

Aa593作为新型效应蛋白的特性与功能

通过酵母双杂交(Y2H)文库筛选，研究人员从链格孢中鉴定出一个预测效应蛋白CC77DRAFT_360593(Aa593)。该蛋白N端1-17位氨基酸为信号肽(SP)，无跨膜结构、糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位点、线粒体定位信号和保守结构域。

实验证实Aa593能够诱导本氏烟细胞死亡。酵母分泌陷阱和2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)试验证明Aa593的信号肽具有分泌功能。将表达Aa593-GFP的链格孢菌株接种到菊花叶片上，24小时后在植物细胞核和其他亚细胞结构中观察到绿色荧光信号，表明Aa593能够被递送到植物细胞内。

亚细胞定位显示，全长Aa593和缺失信号肽的Aa593-ΔSP蛋白均分布于烟草细胞各处。农杆菌介导的瞬时表达发现，Aa593能够诱导本氏烟和菊花叶片细胞死亡。纯化的Aa593-His蛋白同样可诱导菊花细胞死亡。此外，接种重组Aa593-His蛋白24小时后，防御相关基因(CmHSR203J、CmPR1、CmPR2、CmLOX、CmSOBIR1、CmPDF1.2、CmBIK1和CmEDS5)表达呈现下调趋势，表明Aa593进入植物细胞后抑制免疫防御反应。

Aa593通过劫持CmNAC29-CmNCED3模块增强病原毒性

为评估Aa593对链格孢毒力的贡献，研究人员构建了Aa593缺失突变体(ΔAa593)和回补菌株(ΔAa593-C)。与野生型F20(F20-WT)和回补菌株相比，ΔAa593突变体菌落形态无显著变化，但菌丝生长速率降低。接种实验显示，ΔAa593突变体引起的病害症状显著减轻，病斑面积明显减小。

即使增加ΔAa593突变体的接种菌丝量，病害严重度和病斑面积仍未能达到野生型正常接种量的水平。相关性分析发现病斑面积与生物量间并非严格比例关系，而是呈斜率<1的正相关。RT-qPCR分析表明，接种ΔAa593突变体的菊花叶片中免疫相关标记基因表达显著高于接种野生型的植株，证明ΔAa593突变体致病性减弱主要源于抑制植物免疫能力下降而非单纯生长受损。

构建OE-Aa593菊花株系进一步验证功能，发现过表达株系出现更严重的病害症状和更大的病斑面积。在本氏烟中瞬时过表达Aa593和在拟南芥中稳定过表达Aa593也获得类似结果，共同证明Aa593贡献于链格孢的完全毒力。

分子机制深入解析

基因表达和激素水平分析发现，与野生型相比，OE-Aa593植株中CmNCED3表达显著上调，内源ABA水平升高。虽然Aa593在酵母中显示转录自激活活性，但Y1H试验表明Aa593不直接结合CmNCED3启动子，说明其可能间接调控CmNCED3表达。

菊花原生质体瞬时试验显示，当同时存在p35S::CmNAC29和p35S::Aa593时，LUC/REN比值显著高于单独使用p35S::CmNAC29，表明Aa593增强CmNAC29对下游基因CmNCED3的转录活性。进一步转录活性分析发现，Aa593有助于增强CmNAC29的转录激活能力。

EMSA实验表明，随着梯度浓度Aa593-His的加入，结合条带保持不变，说明Aa593不改变CmNAC29与CmNCED3启动子的结合能力。

外源ABA处理能够补偿ΔAa593突变体丧失的毒力，用氟啶酮(ABA合成抑制剂)处理本氏烟叶片后，Aa593对免疫标记基因(NbPR1、NbPR2、NbGLNb、NbSOBIR1、NbLOX和NbHSR203J)的抑制程度降低，其中对NbSOBIR1、NbLOX和NbHSR203J的抑制完全解除，表明Aa593的毒力部分依赖于ABA通路。

接种实验表明，与接种F20-WT相比，接种ΔAa593突变体的菊花叶片中CmNAC29表达水平和ABA含量较低。瞬时转化试验发现，在野生型和amiR-CmNAC29干扰系原生质体中引入p35S::Aa593和pCmNCED3::LUC质粒后，LUC/REN值均显著增加，但在amiR-CmNAC29原生质体中增幅明显减小，表明Aa593部分依赖CmNAC29来调控CmNCED3转录。

接种试验进一步证实，amiR-CmNAC29植株无论接种F20-WT还是ΔAa593突变体都表现出更高的抗性，且接种ΔAa593突变体后病斑面积进一步减小。在OE-Aa593菊花植株中瞬时干扰CmNAC29表达，发现敲低CmNAC29表达抑制了Aa593介导的致病性。

讨论与展望

本研究首次发现菊花中CmNAC29作为易感因子通过直接激活ABA生物合成关键基因CmNCED3的表达而发挥作用。与拟南芥中同源蛋白AtNAP/ANAC029通过靶向ABA合成通路基因AAO3正向调控叶片衰老的机制不同，CmNAC29通过结合CmNCED3启动子介导ABA生物合成的转录调控，表明同源基因在同一通路中可能具有不同的调控机制。

ABA作为重要的植物激素，在植物免疫中既发挥正向也发挥负向调控作用。本研究表明外源施用ABA增强菊花对链格孢的易感性，说明ABA对抗坏死营养型真菌侵染中充当负调控因子。ABA通过多种机制发挥植物免疫负调控作用，包括阻断水杨酸介导的系统获得性免疫，以及茉莉酸和乙烯介导的防御信号传导。本研究鉴定到CmNAC29作为菊花中新型转录激活因子，通过激活CmNCED3表达参与ABA生物合成的调控，从而增强植物对链格孢的易感性，这一发现增进了我们对通过ABA调控抗病性分子机制的理解。

在病原菌与宿主植物长期"军备竞赛"进化过程中，效应蛋白靶向植物激素通路关键组分促进病原侵染是一种有效策略。本研究鉴定到链格孢中新型效应蛋白Aa593与菊花CmNAC29互作，间接劫持植物ABA合成通路，导致激素失衡，促进链格孢侵染。这些发现表明效应蛋白可通过靶向植物激素通路关键组分促进病原入侵，为相关坏死营养型真菌病害研究提供基础，有助于制定抗病策略。

基于上述研究结果，我们提出一个解释链格孢通过Aa593和CmNAC29侵染菊花的假设模型：在无胁迫情况下，CmNAC29正向调控CmNCED3表达，促进合成满足植物正常生长发育所需的ABA；当链格孢入侵菊花宿主植物时，分泌效应蛋白Aa593，进入细胞核后与转录因子CmNAC29互作，通过上调ABA生物合成通路关键基因CmNCED3增强ABA生物合成，从而削弱菊花对链格孢的抗性。

该研究不仅揭示了真菌效应蛋白靶向植物激素信号通路增强毒力的机制，为理解坏死营养型真菌致病机理提供了新视角，也为菊花黑斑病的防控提供了潜在分子靶标，对发展绿色防控策略具有重要理论指导意义。