搅拌罐生物反应器中单克隆抗体CHO补料分批生产的放大：流体力学条件与补料策略对产量提升的关键影响

本文系统探讨了CHO细胞生产单抗过程中流体力学参数（如P/V、搅拌桨配置）与补料策略的优化对放大生产的影响。研究发现低体积补料方案可避免渗透压骤升，将产量提高33%；通过恒定体积功率输入（P/V）和通气率（vvm）成功实现从1L到10L的线性放大，为生物工艺放大提供了关键理论与实践依据。

　　

2 材料与方法

2.1 小规模细胞培养维持与预培养

研究采用两种不同的可诱导CHO-GS稳定克隆株，分别生产单克隆抗体帕利珠单抗（Product A）和奥马珠单抗（Product B）。细胞系通过cumate诱导表达系统实现外源基因的可控表达，在无血清培养基中通过悬浮培养进行扩增。细胞冻存于含7.5% DMSO的BalanCD CHO Growth A培养基中，复苏后于125mL至2L摇瓶中逐步扩增，培养条件维持在37°C、120RPM，每2-3天传代一次以维持细胞密度在0.2–3.0×10⁶ cells/mL范围内。

2.2 生物反应器细胞培养与操作条件

在1.3L和14L BioFlo120生物反应器中进行补料分批培养，初始接种密度为0.3×10⁶ cells/mL。培养基中添加0.1% Kolliphor P188和50μM MSX，采用0.8X BalanCD CHO Feed4进行脉冲补料。诱导时添加0.1%消泡剂，并通过二氧化碳喷溅和碱添加维持pH在7.0±0.2。溶解氧（DO）通过表面通气和级联通气控制，培养终止条件为细胞存活率低于70%。

2.2.1 低体积与高体积补料策略

低体积补料策略（LFS）通过补充葡萄糖维持浓度高于17mM，而高体积策略（HFS）则补充至33mM。补料体积占初始培养体积的比例在不同时间点有显著差异：LFS总补料量为37.5%，HFS为46%。这种差异导致HFS培养后期渗透压升至419mOsm/kg，接近CHO细胞耐受临界值450mOsm/kg，从而引起存活率下降。

2.2.2 搅拌桨数量与混合

研究比较了单桨和双桨配置对培养的影响。通过调整搅拌速率使体积功率输入（P/V）恒定在35W/m³，双桨系统的叶尖速度较低（0.45m/s），而单桨系统较高（0.52m/s）。双桨系统通过分散混合能量降低了局部剪切力，但气体传递系数（k_La）略低于单桨系统。

2.2.3 通气策略与空气帽

溶解氧控制采用级联通气策略：先通空气直至达到预设最大流量（空气帽，AC），随后补充纯氧。研究测试了低（1mL/min）、中（2mL/min）、高（12.3mL/min）三种AC设置，对应不同的体积通气率（vvm）。高AC条件导致总通气量增加，气泡破裂产生的剪切应力加剧了细胞死亡。

2.2.4 放大至10L生物反应器

放大过程以恒定P/V（22–29W/m³）和vvm（0.033min^-1）为核心策略。10L反应器通过调整搅拌速率和通气流量维持与1L反应器相同的流体力学环境，最终实现了可比的细胞生长和产物滴度。

2.3 取样与样品处理

定期取样检测细胞密度、存活率、代谢物（葡萄糖、乳酸、氨）浓度和渗透压。单抗滴度通过Protein A HPLC测定，细胞特异性生产率（qP）和空间时间产率（STY）通过公式计算。数据处理中考虑了培养体积变化对积分活细胞密度（IVCC）计算的影响。

3 结果与讨论

3.1 补料策略的影响

LFS培养通过避免渗透压骤升（维持在348mOsm/kg），将细胞存活率延长至7DPI以上，最终体积滴度较HFS提高33%。HFS培养在4DPI补料后渗透压急剧上升，导致细胞存活率迅速下降。此外，LFS获得的总产物量（1511mg）也高于HFS（1190mg），证明低体积补料在维持细胞健康和提升产量方面的优势。

3.2 搅拌桨数量与通气策略的影响

中AC条件（2mL/min）在单桨系统中获得最高滴度（1617mg/L），而高AC（12.3mL/min）因剪切应力导致早期细胞死亡。双桨系统在相同P/V下叶尖速度较低，减少了剪切损伤，但气体传递效率略低。研究表明，适中的通气策略能在供氧与剪切应力间取得平衡，最大化细胞性能。

3.3 从1L到10L的放大

通过恒定P/V和vvm策略，10L反应器成功重现了1L水平的细胞生长（VCD）、存活率和产物滴度。放大过程中仅需根据体积比例调整通气流量和搅拌速率，证明该策略在不同规模下的适用性。

3.4 工艺向不同产品的转移

将相同培养策略应用于Product B的两个克隆株，结果显示克隆2较早进入乳酸消耗阶段，渗透压上升较缓（峰值380mOsm/kg），表现出更优的代谢特性。两个克隆在生物反应器中的滴度均达到摇瓶水平的90%–109%，证明了工艺的稳健性和通用性。

3.5 流体力学条件对生产力的影响

通过维持恒定培养体积或调整搅拌/通气以保持P/V和vvm恒定，可显著提升空间时间产率（STY）。恒定体积培养避免了因补料导致的体积增加，从而无需提高搅拌速率（即不增加叶尖速度），进一步降低了剪切应力，使STY在16DPI仍维持较高水平。

4 结论

本研究证实了低体积补料策略在控制渗透压、延长细胞存活方面的核心价值，以及级联通气策略中AC优化对平衡氧气传递与剪切应力的重要性。通过恒定P/V和vvm的成功放大，为大规模生物工艺提供了可靠方法。研究还表明，该工艺适用于不同抗体和细胞系，展现了良好的通用性与稳定性。