乙酰化表没食子儿茶素没食子酸酯与抗坏血酸棕榈酸酯：抗氧化活性及抑制鱼糜和虾油脂质氧化的对比研究

本研究对比了乙酰化表没食子儿茶素没食子酸酯（A-EGCG）和抗坏血酸棕榈酸酯（AP）的抗氧化效能，通过多种体外实验（DPPH、ABTS自由基清除、FRAP还原力及金属螯合能力）和食品模型（β-胡萝卜素-亚油酸体系、卵磷脂脂质体）证实AP在自由基清除方面更具优势，而A-EGCG擅长金属螯合。在鱼糜（冰藏）和虾油（30°C贮藏）的实际应用中，AP能更有效延缓脂质氧化，降低过氧化值（PV）和硫代巴比妥酸反应物（TBARS），并通过FTIR光谱（1745 cm?1峰变化）及脂肪酸谱（EPA、DHA保留率）验证其保护作用，为天然抗氧化剂在富含多不饱和脂肪酸（PUFA）的水产品中的应用提供了理论依据。

　　

1 引言

食品劣变和酸败主要由脂质氧化引起，这对食品工业构成重大挑战，因其导致品质下降和经济损失。此外，脂质氧化产物对人类健康有负面影响。多不饱和脂肪酸（PUFA）易与氧反应而降解，直接决定脂质氧化速率。因此，使用抗氧化剂延缓食品中脂质氧化日益重要。天然抗氧化剂已被广泛认可为缓解脂质氧化及其有害影响的有效手段。脂质氧化是食品加工、储存和分销过程中发生的关键化学过程，其氧化稳定性受脂质物理形态（如散装油或水包油乳液）的影响。抗氧化剂极性悖论理论指出，亲脂性抗氧化剂在高表面/体积比系统（如乳液、胶束或膜）中表现更佳，而亲水性抗氧化剂在散装油中特别有效。脂质氧化主要发生在空气-油和水-油界面。此外，水包油乳液中分散颗粒周围的界面膜数量显著影响脂质氧化速率。具有一定两亲特性的抗氧化剂可有效定位在界面，从而增强其防止脂质氧化的能力。

抗坏血酸棕榈酸酯（AP）（6-O-棕榈酰-L-抗坏血酸）是一种源自抗坏血酸或维生素C的两亲化合物，具有与抗坏血酸相似的基本性质。AP被认为对人类消费是安全的添加剂，并被合法允许作为膳食补充剂。与抗坏血酸相比，AP具有更高的热稳定性，并可提高油的抗氧化能力。表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯（EGCG）约占茶多酚的50%，与其生物效应相关。其抗氧化特性具有增强含PUFA食品稳定性的潜力。然而，EGCG的亲水性限制了其在脂基产品中的应用。EGCG的乙酰化提高了其在油中的溶解度，增强了其作为各种脂质食品中天然抗氧化剂的有效性。因此，具有增强油溶性的乙酰化EGCG（A-EGCG）可用于增强脂基食品系统的氧化稳定性。在安全性方面，EGCG及其衍生物（包括A-EGCG）通常被认为是安全的，尽管根据EFSA食品添加剂和食品中添加的营养来源（ANS）小组的报告，较高的补充摄入量（>800 mg/天）可能会增加肝毒性风险。因此，本研究中所用A-EGCG的浓度保持在食品应用认为安全的水平。据我们所知，关于两亲性抗氧化剂的抗氧化活性及其在不同食品系统中效能的报告有限。特别是，A-EGCG和AP在海产品或衍生物中的使用很少。因此，本研究的目的是研究A-EGCG与AP在不同浓度下的体外抗氧化特性，并监测这两种抗氧化剂在鱼糜和虾油（SO）中防止脂质氧化的效率，分别在碎冰中储存15天和在30°C下储存。

2 材料与方法

2.1 化学品

分析级化学品，包括AP，购自Sigma-Aldrich（美国），溶剂购自Lab-Scan（泰国）。乙酰化EGCG（98%）源自西安聚龙生物技术有限公司（中国）。

2.2 乙酰化EGCG与抗坏血酸棕榈酸酯体外抗氧化活性的比较研究

在分析之前，将A-EGCG和AP溶解在甲醇中，浓度为0.5、1、5和10 mg/L，并通过各种体外测定评估其抗氧化性能。DPPH和ABTS自由基清除活性（RS-As）通过将样品与各自的自由基混合测定。分别在517和734 nm读取吸光度，活性表示为μmol TE/mL。测定铁还原抗氧化能力（FRAP），在593 nm读取反应混合物的吸光度，并表示为μmol TE/mL。通过与FeCl₂和ferrozine的相互作用测量金属螯合活性（MC-A）。在562 nm读取吸光度，活性报告为μmol EDTA当量（EE）/mL样品。

2.3 乙酰化EGCG与抗坏血酸棕榈酸酯在不同模型系统中防止脂质氧化的比较研究

2.3.1 β-胡萝卜素-亚油酸模型系统

首先，将0.06 g亚油酸和0.6 g Tween的混合物与β-胡萝卜素（2.5 mg/5 mL氯仿）结合。然后加入150 mL充氧水，剧烈摇晃1分钟以形成乳液。将A-EGCG和AP直接溶解在β-胡萝卜素乳液中，浓度为100和200 mg/L。不含抗氧化剂的乳液作为对照。在50°C下，每15分钟在470 nm监测氧化稳定性，持续6小时。

2.3.2 卵磷脂脂质体系统

将卵磷脂悬浮在去离子水中，最终浓度为8 mg/mL，并超声处理30分钟以形成脂质体。随后，加入醋酸铜（0.15 M），并在37°C以120 rpm振荡。在48小时内定期取样测量硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）。结果报告为mg MDA当量/mL脂质体。

2.4 乙酰化EGCG与抗坏血酸棕榈酸酯对鱼糜和虾油脂质氧化预防效果的比较研究

2.4.1 鱼糜制备

从泰国合艾当地市场获取鲭鱼（Rastrelliger kanagurta）（捕获后24小时）。根据方法制备糜，一份（100 g）作为对照（不含抗氧化剂）。其余4份（各100 g）与A-EGCG或AP混合，最终浓度为100和200 mg/kg糜。浓度基于初步研究和EGCG及其衍生物在脂质丰富食品中报道的有效范围选择，确保在食品系统适用水平内具有足够的抗氧化活性。彻底混合以确保样品均匀性。每份样品装入拉链袋中，嵌入碎冰中，糜与冰的比例为1:2（w/w），每天更换新冰。采用冰藏以模拟传统海鲜储存条件，并防止冷藏储存期间可能发生的脱水。在15天的储存期间，每3天取样进行分析。分析前，使用Bligh和Dyer方法从鱼糜中提取油。

2.4.2 虾油制备

从太平洋白虾的冷冻肝胰腺中提取虾油。将A-EGCG和AP添加到SO中，浓度为100和200 mg/L。将样品放入小瓶并用铝箔覆盖。在30°C储存15天期间，每3天进行过氧化值（PV）和硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）分析。

2.4.3 分析

2.4.3.1 过氧化值

从鱼糜或虾油中提取的油（0.5 g）与22 mL氯仿-甲醇（2:1, v/v）溶液均质（13,500 rpm, 2分钟）。滤液（7 mL）加入0.5% NaCl（2 mL）并涡旋45秒。离心（3000 × g, 3分钟, 4°C）后，收集底层用于PV估计。PV报告为mg枯烯氢过氧化物/kg样品。

2.4.3.2 硫代巴比妥酸反应物质

首先从糜中提取油以避免蛋白质、水和其他成分的干扰。程序在2°C–4°C进行，以最小化样品制备过程中的氧化。从鱼糜或虾油中提取的油（0.5 g）与2.5 mL TBA溶液混合，煮沸10分钟后离心（5000 g; 10分钟）。在532 nm记录吸光度，值表示为mg丙二醛（MDA）当量/kg样品。

2.4.3.3 脂肪酸谱

从鱼糜中提取油如上所述。通过转甲基化制备脂肪酸甲酯（FAMEs）。使用安捷伦7890B GC配备FID进行分析，结果表示为g/100 g油。

2.4.3.4 FTIR光谱

将200 μL油样品放在FTIR晶体上，使用Bruker Vertex 70仪器（德国布鲁克）分析，在4000–400 cm^?1范围内捕获吸收光谱。所有数据使用OPUS 3.0软件处理。

2.5 统计分析

整个研究采用完全随机设计。实验进行三次重复，数据通过单因素方差分析。使用SPSS版本14.0（芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行Duncan多重范围检验的平均比较。

3 结果与讨论

3.1 DPPH和ABTS RS-As

AP和A-EGCG能有效清除DPPH和ABTS自由基。活性随着浓度从0.5增加到10 mg/L而增强。AP在0.5–10 mg/L浓度下显示DPPH和ABTS RS-As范围分别为17.58至86.22 μmol TE/mL和139.67至533.57 μmol TE/mL。A-EGCG在相同浓度范围内显示DPPH RS-As为23.08–97.20 μmol TE/mL和ABTS RS-As为248.56–631.89 μmol TE/mL。在相同浓度下，AP的DPPH RS-As高于A-EGCG。这可能归因于前者结构中更高的羟基化程度。此外，AP表现出还原特性，可能归因于C2和C3碳上的双键，辅以位于C2、C3、C5和C6的羟基（─OH）。因此，它们对自由基的氢捐赠活性更明显。A-EGCG也显示出潜在的DPPH RS-As和ABTS RS-As。与AP相比，A-EGCG在清除测试自由基方面效果较低。这可能归因于EGCG的一些羟基被乙酰基（CH₃CO─）取代，这可能部分导致抗氧化特性的丧失。然而，添加乙酰基对于增强A-EGCG在油中的溶解度至关重要。因此，AP中更多的活性羟基可能有助于其优于A-EGCG的DPPH和ABTS RS-As。

3.2 铁还原抗氧化能力

A-EGCG和AP的FRAP显示它们能够作为还原剂，提供电子给铁离子。A-EGCG（0.5–10 mg/L）和AP（0.5–10 mg/L）的FRAP范围分别为176.83–797.53 μmol TE/mL和183.53–888.7 μmol TE/mL。AP表现出比A-EGCG更高的FRAP，表明其捐赠电子以将铁离子还原为亚铁离子的能力更高。这一结果突出了它们缓解脂质氧化的抗氧化潜力。结果与AP更高的DPPH RS-As和ABTS RS-As一致。形成AP一部分的抗坏血酸呈现具有羟基（─OH）和含双键环的环状结构。羟基通过捐赠电子中和自由基在其抗氧化活性中起重要作用。AP中的棕榈酸是一种长链脂肪酸，不直接参与自由基清除，但有助于稳定性并使化合物脂溶性。A-EGCG的FRAP低于AP，可能源于游离羟基较少和提供自由电子的能力。然而，据报道，在EGCG中引入乙酰基通过提高溶解度、稳定性和与自由基相互作用的能力改变化学结构。总体而言，AP表现出比A-EGCG更高的FRAP。

3.3 金属螯合活性

A-EGCG和AP的MC-A说明两者都具有螯合铁的能力，从而有助于延迟脂质氧化的发生。A-EGCG（0.5–10 mg/L）和AP（0.5–10 mg/L）的MC-A范围分别为20.04–47.83 μmol EE/mL和15.83–38.48 μmol EE/mL。抗氧化剂螯合金属离子的能力显著取决于邻位羟基的数量。A-EGCG在所有测试浓度下表现出比AP更高的MC-A。这主要归因于A-EGCG中儿茶酚和没食子酸部分的存在，为Fe²⁺和Fe³⁺结合提供最佳结构取向，能够螯合促氧化金属，从而减少它们在脂质氧化中的催化活性。在鱼肌肉系统中，从血红素蛋白（如血红蛋白和肌红蛋白）释放的游离铁可作为有效的促氧化剂，通过产生羟基自由基的Fenton反应加速脂质过氧化。由于其多羟基化结构，A-EGCG可以通过螯合具有氧化还原特性的金属或清除自由基作为有效的抗氧化剂。AP和A-EGCG的金属螯合效率不同，并且与DPPH RS-A、ABTS RS-A和FRAP不相关。尽管AP由于其电子捐赠基团表现出更高的还原能力，但其螯合效率低于A-EGCG。结果表明，各种抗氧化剂可以有效地中和不同类型的自由基和/或以不同方式螯合金属离子。因此，多种测定对于确认不同抗氧化剂的抗氧化活性至关重要，因为它们的机制或作用方式可能不同。

3.4 AP与A-EGCG在不同模型系统中保护脂质氧化的比较研究

3.4.1 β-胡萝卜素-亚油酸模型系统

在β-胡萝卜素-亚油酸模型系统中，A-EGCG和AP都具有剂量依赖性的防止脂质氧化能力。对于两种抗氧化剂，较高浓度（200 mg/L）表现出优于较低对应物（100 mg/L）的抑制氧化效果。A₄₇₀的降低表明β-胡萝卜素氧化，反映了由亚油酸氧化产生的自由基的形成。这些自由基攻击高度不饱和的β-胡萝卜素，使其颜色从橙色变为较浅的色调。与对照（不含抗氧化剂）相比，A-EGCG和AP都通过中断脂质过氧化，特别是通过中和来自亚油酸的自由基，降低了乳液中β-胡萝卜素的褪色。这种降低的亚油酸氧化可能防止了β-胡萝卜素的降解，从而保留了其颜色。AP在所有测试浓度下表现出比A-EGCG更高的减少脂质氧化效果。抗氧化效能的变异可能由它们不同的结构特性和功能基团引起。AP的两亲性质主要有助于其更高的抗氧化活性。这可能使AP能够定位在亚油酸和水的界面，从而潜在地增强其效能。因此，AP可以有效地抑制乳液系统中的脂质氧化，其定位在脂质/水界面以发挥最大效果。对于A-EGCG，假设乙酰部分内的羰基贡献了一定程度的极性，使其比AP更亲水。因此，A-EGCG优选定位在水相中。因此，AP在β-胡萝卜素乳液系统中显示出比A-EGCG更大的防止脂质氧化潜力。

3.4.2 卵磷脂脂质体模型系统

卵磷脂脂质体系统形成脂质双层。卵磷脂中的不饱和脂肪酸是氧化的主要目标。抗氧化剂能够保护磷脂双层免受氧化，从而评估它们防止脂质过氧化的能力。通过评估次级脂质氧化产物的产生研究了A-EGCG和AP在卵磷脂脂质体系统中的抗氧化特性。在48小时的孵育期间，A-EGCG具有延迟脂质氧化过程的潜力。然而，其效能显著低于AP，如含AP的卵磷脂系统中观察到的较低TBARS值所示。通常，不含添加抗氧化剂的对照样品表现出比含抗氧化剂样品更高的氧化。脂质体作为评估脂基食品或脂蛋白颗粒中抗氧化活性的合适模型。含有200 mg/L AP的卵磷脂脂质体系统显示最低的TBARS，而含有100 mg/L AP的样品观察到略高的值。总体而言，在相同使用浓度下，AP显示出比A-EGCG更高的预防效果。这一结果再次证实了A-EGCG和AP的剂量依赖性活性。此外，AP的亲水区域定位在脂质体结构中卵磷脂的头部部分。这种定位可能通过自由基清除机制抑制脂质体氧化。此外，由于其螯合金属的能力，AP可以与系统中存在的促氧化剂Cu²⁺结合。因此，通过加入AP抑制了脂质体的氧化。因此，在卵磷脂脂质体模型系统中，AP表现出比A-EGCG更显著的抑制脂质体氧化能力。两种化合物的抗氧化活性突出了它们缓解脂质氧化的潜力，但AP具有更高的效能。

3.5 AP与A-EGCG在鱼糜和虾油中保护脂质氧化的比较研究

3.5.1 鱼糜

在对照样品中，PV显著上升至第9天。之后，直至第15天未记录到显著变化。在整个储存期间，对照样品表现出比含A-EGCG或AP的样品更大的PV。添加200 mg/Kg AP的样品具有较低的PV，其次是添加100 mg/Kg AP和对照。添加A-EGCG的鱼糜也发现类似趋势。结果显示了AP在鱼糜中的有效抗氧化活性。此外，AP基于体外抗氧化测定表现出更高的抗氧化活性，除了金属螯合活性。此外，AP在β-胡萝卜素-亚油酸和卵磷脂脂质体模型系统中都表现出比A-EGCG更高的活性。AP通过螯合糜中的特定金属离子和中和脂质自由基，有效延迟了脂质氧化的引发和传播阶段。鲭鱼是一种黑肉鱼，糜含有血红素蛋白，包括血红蛋白和肌红蛋白。在储存期间，这些蛋白质可能变性，血红素基团的破坏可能发生，从而释放游离铁到糜中。这些游离铁可作为促氧化剂，增强脂质氧化。捐赠电子后，产生的低能抗氧化自由基具有减少进一步引发不饱和脂肪酸氧化的倾向。抗氧化剂的潜力对于抑制和减缓鱼组织中的脂质降解至关重要。因此，添加A-EGCG的样品比添加AP的样品具有更大的PV。

所有样品在储存期间显示TBARS增加。对照样品的TBARS在储存至9天时急剧增加，然后直至储存结束保持恒定。在第15天，注意到TBARS减少。这种效应可能由挥发性氧化产物的分解引起。MDA和其他在脂质氧化过程中形成的低分子量碳化合物不稳定，分解成不被TBARS测定量化的有机酸和醇。在冷冻储存期间，鲭鱼中PV和TBARS水平持续增加，随后在10周后两者急剧下降。TBARS的下降可能受TBA反应物质与鱼肌肉中蛋白质相互作用的影响。在添加抗氧化剂的样品中，TBARS值在最初3天储存期间没有显著变化。随后，除添加200 mg/Kg A-EGCG或AP的样品显示适度增加外，所有样品的TBARS值显著增加至第12天。在第15天，含200 mg/Kg AP的样品在所有样品中显示最低的TBARS值。A-EGCG和AP都表现出清除自由基和螯合金属的活性，导致鱼糜中氧化减少。A-EGCG和AP通过螯合Fe²⁺或Fe³⁺离子有效减少糜中的脂质氧化。

表1显示了冰藏15天后从鲭鱼糜提取的油的脂肪酸组成。最初（第0天），对照的脂肪酸谱与其他样品 closely resembled。在从鲭鱼糜提取的脂质中，棕榈酸（C16:0）是主要脂肪酸，其次是油酸（C18:1）。这些结果与报道的发现一致。C16:0也被确定为鲭鱼糜中的主要饱和脂肪酸（SFA），而C18:1是主要单不饱和脂肪酸（MUFA）。在PUFA中，DHA是主要脂肪酸，其次是EPA。在本研究中，DHA大约比EPA多两倍。这些PUFA主要存在于细胞膜中，特别是在磷脂中。在第15天，观察到MUFA和PUFA减少，而SFA的比例在所有样品中增加。在添加抗氧化剂的样品中，AP-200样品具有比A-EGCG-200样品更高的EPA和DHA（3.49和8.29 g/100 g）。总体而言，对照样品（不含抗氧化剂）在储存后具有最低的EPA和DHA含量（2.65和6.83 g/100 g）。结果再次证实，200 mg/Kg AP在保护鲭鱼糜免受氧化方面比相同浓度的A-EGCG更有效。这一发现与在AP-200样品中检测到的降低的PV和TBARS相关。

图4A说明了添加不同浓度AP和A-EGCG的糜提取脂质在冰藏15天前后的FTIR光谱变化。最初（第0天），所有样品的光谱与对照相似。总体而言，光谱模式显示与养殖鲑鱼片和沙丁鱼肌肉脂质报道的功能基团振动区域相当。例如，3012 cm^?1处的峰对应于顺式配置双键的C─H拉伸。脂肪族CH₂基团的拉伸振动出现在2922 cm^?1（不对称）和2853 cm^?1（对称）。甘油三酯中C═O基团的拉伸振动带出现在1745 cm^?1附近。在鲑鱼脂质中 around 1746 cm^?1和沙丁鱼脂质中 approximately 1740 cm^?1观察到微小变化。1465 cm^?1处的吸收带与脂肪族CH₂和CH₃脂肪族基团的弯曲振动相关，而1143 cm^?1处的峰对应于CH₂拉伸振动，反映了脂质样品中存在的饱和酰基链的相对量。储存15天后，1745 cm^?1处带的振幅减少，这归因于脂质氧化衍生物如醛和酮的形成，通常出现在1735–1710 cm^?1的波数范围内。在所有样品中，AP-200显示在1745 cm^?1处峰强度减少最少，其次是A-EGCG-200，与第0天发现的相比。

3.5.2 虾油

从副产物如肝胰腺和头胸甲获得的虾油富含PUFA，并在食品和营养保健品应用中日益使用。然而，其高氧化敏感性缩短了保质期并降低了功能性。因此，需要潜在的抗氧化剂来防止氧化，从而在储存期间保持质量。PV是一种广泛用于评估脂质氧化早期阶段产生的氢过氧化物的方法，显示不加抗氧化剂的SO显著增加， notably up to 20 days of storage。添加抗氧化剂的SO显示PV逐渐增加；然而，增加速率较低，尤其是对于添加AP的SO样品。PV的上升表明脂质氧化进入传播阶段，其中脂质自由基与氧相互作用产生过氧自由基，随后攻击邻近的脂质分子。在对照中，PV在储存期结束时略微下降，可能由氢过氧化物分解为次级氧化产物引起。在等效浓度下，添加AP的SO在整个储存期间比添加A-EGCG的具有更低的PV。储存15天后，高浓度AP的样品始终显示比其他样品更低的PV值。这一发现进一步证实，加入AP增强了SO的氧化稳定性。

在储存期间，SO中的TBARS值逐渐增加，反映了次级氧化产物的积累。TBARS通常用作氢过氧化物在脂质氧化高级阶段分解为这些次级氧化产物的指标。具体地，氢过氧化物分解为MDA，是氧化脂质中不良风味的关键贡献者。重要的是，添加AP的SO的TBARS值低于添加A-EGCG的SO，表明AP在SO中作为抗氧化剂比A-EGCG更有效。在SO中加入AP在储存期间对TBARS形成表现出显著的预防效果。这可能归因于AP的高抗氧化能力，包括有效的自由基清除和抑制氢过氧化物降解为次级氧化产物。

SO储存15天后，脂肪酸谱（表2）与第0天、不加和加不同浓度抗氧化剂的那些比较。最初，对照样品的脂肪酸组成与其他处理 closely matched，具有19.16 g/100 g SFA、27.19 g/100 g MUFA和39.74 g/100 g PUFA。油酸（29.80 g/100 g oil）是普遍脂肪酸，其次是亚油酸和棕榈酸。从肝胰腺和头胸甲分离的SO的类似脂肪酸组成被观察到。储存（15天）后，所有SO样品显示MUFA和PUFA含量略微减少。这种变化与增加的SFA相关。MUFA和PUFA的减少可能归因于它们在长期储存期间对氧化的敏感性。然而，添加200 ppm AP的SO显示MUFA和PUFA含量减少较少。这与15天后在AP处理组中检测到的初级和次级氧化产物水平降低一致。这些发现表明，添加AP限制了MUFA和PUFA的损失，如油酸和亚油酸更高保留率所证明。

SO在储存后带有和不带抗氧化剂的FTIR光谱与初始光谱（第0天）比较，如图4B所示。这些光谱提供了储存期间氧化的见解，导致功能基团的改变。3009 cm^?1处的吸收带与顺式C═C双键的拉伸振动相关，显示储存期间强度降低，表明不饱和脂肪酸的降解。CH₂对称和不对称拉伸振动分别记录在2852和2922 cm^?1附近。在1742 cm^?1处，一个清晰的峰表示甘油三酯酯键中羰基（C═O）的拉伸。1461 cm^?1处的带对应于CH₂剪刀式振动，1160 cm^?1处的峰代表面外变形。此外，CH₂摇摆模式在720 cm^?1处明显。最初，所有样品的光谱与对照 closely resembled。然而，在第30天，注意到显著的光谱变化。所有样品中3009 cm^?1带强度降低表明由于储存期间氧化导致双键损失。同时，样品中2852 cm^?1处强度增加表明醛积累，是脂质氧化的标志。值得注意的是，AP-200样品在2852 cm^?1处显示最低振幅，与其通过TBARS测量的降低氧化水平一致。此外，1742 cm^?1峰在储存15天后也显示强度降低，暗示氧化油中酯和羧酸等含羰基化合物的减少。在第30天，对照样品在1742 cm^?1处显示最高减少，表明更广泛的氧化。

4 结论

A-EGCG和AP在抑制脂质氧化