尿液细胞外囊泡DNA甲基化检测在前列腺癌诊断与分型中的创新价值与临床潜力

本研究针对前列腺癌(PCa)缺乏便捷、无创、高特异性诊断标志物的临床难题，创新性地探索了尿液细胞外囊泡(EV)DNA甲基化检测的诊断价值。研究人员通过建立EV DNA甲基化检测体系，筛选出6个特异性甲基化位点(MACF1、LINC01359-1、LINC01359-2、ADCY4、GAPLINC、C19orf25)，构建了PCa诊断模型(PCa_seek AUC=0.74)和侵袭性PCa鉴别模型(proPCa_seek1 AUC=0.91)。该研究为PCa无创诊断提供了新思路，奠定了EV DNA研究的理论基础。

　　

前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)作为男性最常见的恶性肿瘤之一，其诊断一直面临重大挑战。目前临床上广泛使用的前列腺特异性抗原(Prostate-Specific Antigen, PSA)检测虽然简便，但存在明显的局限性——它难以区分良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia, BPH)与恶性肿瘤，更无法鉴别惰性前列腺癌和侵袭性前列腺癌。这种诊断上的模糊性常常导致过度诊断和不必要的侵入性检查，给患者带来身心负担。

随着精准医疗时代到来，液体活检技术为肿瘤诊断带来了新的希望。与传统组织活检相比，液体活检具有无创、可重复采样、能够克服肿瘤异质性等优势。在液体活检的三大靶标（循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)和细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)）中，ctDNA的甲基化检测显示出独特优势。DNA甲基化作为肿瘤中最常见且关键的驱动分子事件，不仅具有高度的时空特异性，还能通过信号放大提高检测灵敏度。研究表明，驱动基因的DNA甲基化改变甚至是早于驱动基因突变发生的早期事件，这使其在肿瘤早期诊断中具有巨大潜力。

然而，基于血液ctDNA的甲基化检测仍存在诸多局限：ctDNA高度碎片化（约200bp），半衰期短（约2小时）；循环游离DNA(cell-free DNA, cfDNA)中肿瘤来源DNA容易被大量正常来源DNA背景干扰；ctDNA主要来自坏死的凋亡细胞，可能无法准确反映活细胞状态。

正是在这样的背景下，研究人员将目光投向了细胞外囊泡DNA这一新兴领域。EVs是由活细胞主动分泌的膜性囊泡，能够携带蛋白质、核酸、代谢物等多种物质，准确反映源细胞状态。与传统ctDNA相比，EV DNA具有明显优势：由活细胞主动分泌，更好反映活细胞状态；DNA片段更大；囊膜保护使内部DNA免于DNase降解和外部污染；可通过亲和捕获方法分离肿瘤来源EVs提高检测特异性。已有研究表明，在早期肿瘤中，肿瘤特异性变化在EV DNA中的富集程度高于cfDNA。

尽管EV DNA在肿瘤诊断中的价值已逐渐受到关注，但相较于突变检测，甲基化检测在EV DNA中的应用尚未广泛开展，其在PCa诊断中的价值更是缺乏深入探索。为了解决这一科学问题，来自西安交通大学第二附属医院检验科的研究团队在《Journal of Advanced Research》上发表了他们的最新研究成果。

研究人员采用了几项关键技术方法：通过差速离心法从尿液和前列腺组织中提取不同亚型EV；利用纳米流式细胞术分析DNA阳性囊泡比例；采用还原代表性亚硫酸氢盐测序(Reduced-Representation Bisulfite Sequencing, RRBS)进行全基因组甲基化分析；构建包含667个PCa特异性甲基化靶标的靶向测序panel；使用甲基化特异性荧光PCR(Methylight PCR)验证标志物性能。研究共纳入86例BPH和109例PCa患者，分为筛查队列（30 BPH/33 PCa）、训练队列（27 BPH/30 PCa）和验证队列（29 BPH/46 PCa）。

EV提取与鉴定

研究人员首先从尿液和组织样本中提取EVs，分离并表征了尿液中的不同EV亚型（总EV、大EV(large EV, lEV)和小EV(small EV, sEV)）。透射电镜显示EVs呈现典型的杯状形态，lEV和总EV中的囊泡直径范围较宽（主要集中在50-300nm），而sEV中的囊泡直径范围较窄（主要30-150nm）。Western blot分析检测了多个EV标志物（TSG101、CD63、HSP70）和阴性标志物（calnexin），证实分离样品具有EV特征。

不同亚型EV DNA的生物学特性

研究人员使用三种方法（无DNase I、DNase I、DNase I+Triton X-100）处理不同亚型EV，探索尿液EV DNA的生物学特性。发现DNA阳性EV约占EV总数的10-30%，lEV中DNA阳性囊泡比例高于sEV。lEV携带的DNA多于sEV，且大部分DNA位于囊泡内部（DNase I处理后DNA浓度降低<50%）；而sEV包含的DNA较少，且主要吸附在囊泡外表面（DNase I处理后DNA浓度降低>50%）。lEV的DNA片段大于sEV。重要的是，无论是lEV还是sEV，都能很好地反映源细胞基因组DNA(genomic DNA, gDNA)的甲基化状态。

EVs预处理方法的选择

通过比较DNase I处理与否对EV DNA检测的影响，研究人员发现两种处理方法观察到的CpG位点高度重合，差异甲基化CpG位点的甲基化变化趋势一致性达90.0%。主坐标分析显示PCa样本存在显著的患者间变异，而不同处理组间甲基化谱一致性良好。DNase I处理会导致DNA浓度降低和组内甲基化谱一致性受损，增加生物标志物筛选难度。考虑到临床转化需求，研究选择在后续EV处理中不使用DNase I。

EV DNA对gDNA的代表性验证

在细胞水平上，EV DNA的甲基化模式与源细胞gDNA显著相关；在临床样本中，组织EV DNA(tissue EV DNA, tEV DNA)与gDNA的甲基化模式高度一致，而尿液EV DNA(urine EV DNA, uEV DNA)与gDNA和tEV DNA的一致性较差。这可能是由于尿液样本成分复杂，含有来自肾脏、膀胱等多种来源的游离核酸。尽管如此，只要能在这种复杂背景中识别出肿瘤特异性差异位点，使用uEV DNA作为诊断标志物仍然是可行的。

PCa特异性甲基化标志物的筛选

研究人员在33例PCa和30例BPH的tEV DNA样本以及15例PCa和10例BPH的uEV DNA样本中进行了RRBS检测，采用滑动窗口法检测BPH和PCa患者EV DNA中的差异甲基化区域(Differentially Methylated Regions, DMRs)，共识别出566个DMRs（482个差异高甲基化区域和84个差异低甲基化区域）。生物信息学分析预测这些差异区域与肿瘤的发生发展高度相关。

基于uEV DNA甲基化标志物的PCa诊断模型构建

研究人员构建了一个包含667个甲基化靶标（覆盖14,570个CpG位点）的靶向测序panel，在新队列（BPH, n=27; PCa, n=30）中进行了测试。采用5折交叉验证方法构建了三个模型：PCa鉴别诊断模型(PCa_seek)和两个侵袭性PCa诊断模型(proPCa_seek1和proPCa_seek2)。PCa_seek模型区分BPH与PCa的AUC为0.72，与PSA联合后AUC提高至0.88；proPCa_seek1模型区分惰性前列腺病变与临床显著PCa的AUC高达0.93，与PSA联合后AUC为0.87；proPCa_seek2模型的AUC为0.79，与PSA联合后AUC为0.87。研究发现有6个位点（MACF1、LINC01359-1、LINC01359-2、ADCY4、GAPLINC、C19orf25）在PCa_seek和proPCa_seek1中共同出现，仅用这6个位点重新建模后，PCa_seek模型的AUC提高至0.74，proPCa_seek1模型的AUC略微降低至0.91。

uEV DNA甲基化标志物对PCa的诊断效能验证

为了便于临床应用，研究人员选择上述6个位点设计引物和探针，使用Methylight PCR在验证队列（BPH, n=29; PCa, n=46）中进一步验证其诊断效能。6个标志物联合区分BPH与PCa的AUC为0.71，与PSA联合后AUC提高至0.79；区分侵袭性PCa与惰性前列腺病变的AUC为0.80，与PSA联合后AUC提高至0.88。

研究结论表明，尿液EV DNA甲基化作为一种新型PCa诊断标志物具有巨大潜力。研究人员全面探索了EV DNA的生物学特性、预处理因素和诊断潜力，为肿瘤标志物研究提供了新的视角。通过全基因组水平的差异甲基化靶标筛选，开发了PCa特异性靶向测序panel，并成功鉴定出多个表现良好诊断效能的EV DNA甲基化标志物。这些发现为改进PCa诊断提供了有前景的途径。

讨论部分强调，与目前主要基于血液cfDNA的甲基化检测相比，尿液EV DNA甲基化检测在诊断PCa特别是临床显著PCa方面可能具有独特优势。研究中发现的6个甲基化位点（MACF1、LINC01359、ADCY4、GAPLINC、C19orf25）不仅可检测，而且可能与PCa的功能相关，它们的甲基化状态可能调节关键的致癌通路，如细胞骨架动力学、cAMP信号和上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)。这种生物学合理性增强了它们作为前列腺癌诊断或预后靶标的潜力。

该研究的局限性包括：Methylight PCR覆盖的CpG位点比靶向测序少，只能计算每个标志物的相对甲基化水平，检测灵敏度相对较低；作为初步探索性研究，仅使用总EV DNA评估诊断价值，未使用免疫亲和方法从尿液中富集前列腺来源的细胞外囊泡；是单中心研究，样本量有限，仅选择了6个位点进行检测。未来研究将采用高通量多重数字PCR方法，同时分析更多CpG位点并精确定量绝对甲基化水平；使用特异性抗体或适配体富集前列腺来源的细胞外囊泡；开展更多甲基化位点和更大队列的多中心研究，以获得具有临床应用价值的标志物。

总之，这项研究深入探索了尿液细胞外囊泡DNA甲基化在前列腺癌诊断中的应用价值，建立了可靠的检测体系，筛选出了具有诊断潜力的特异性甲基化标志物，为前列腺癌的无创诊断和精准分型提供了新的思路和方法，具有重要的临床转化前景。