基于成纤维细胞分化轨迹的瘢痕疙瘩分子分型系统构建及机制研究

《Communications Biology》：Uncovering a fibroblast differentiation-based keloid classification by integration of single-cell and bulk RNA sequencing

为解决瘢痕疙瘩（Keloid）因发病机制不清、缺乏精准分子分型而导致的治疗高复发率难题，研究人员整合单细胞与转录组测序数据，构建了基于成纤维细胞分化相关基因（DEFDRGs）的瘢痕疙瘩诊断分型系统（FDBKC）。该研究将患者分为低、中、高三个分子亚型，揭示了不同亚型在临床表型、免疫浸润及关键通路上的异质性，为瘢痕疙瘩的精准诊断和靶向治疗提供了新的理论依据。

　　

瘢痕疙瘩是一种由异常伤口愈合引起的皮肤纤维增生性疾病，表现为高出皮面、超出原伤口边界的无定形瘢痕，常伴有瘙痒和疼痛，严重影响患者的身心健康。目前，瘢痕疙瘩的治疗手段多样，但单纯手术切除后的复发率高达70%至100%，且常伴有疼痛、周围正常组织萎缩等副作用。究其根本，瘢痕疙瘩的发病机制尚未完全阐明，且其内部存在显著的异质性，导致“一刀切”的治疗方案效果不佳。因此，深入解析瘢痕疙瘩的细胞和分子机制，构建精准的分子分型系统，对于揭示其发病机制、开发新的治疗靶点至关重要。

成纤维细胞是瘢痕疙瘩形成过程中的核心细胞，其异常增殖和过度胶原沉积是瘢痕疙瘩的组织病理学特征。然而，成纤维细胞在瘢痕疙瘩中并非均质的群体，其分化状态和功能异质性在疾病发生发展中的作用尚不明确。为了回答这一问题，海军军医大学第一附属医院烧伤外科张伟、卢建宇、童希瑞等研究人员在《Communications Biology》上发表了一项研究，他们通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和转录组测序（RNA-seq）数据，首次构建了一个基于成纤维细胞分化状态的瘢痕疙瘩分子分型系统，并揭示了不同亚型在临床表型、免疫浸润及关键通路上的异质性，为瘢痕疙瘩的精准诊断和靶向治疗提供了新的理论依据。

关键技术与方法

本研究主要采用了多组学整合分析策略。首先，研究人员利用已发表的单细胞RNA测序数据（GSE163973），对3例瘢痕疙瘩和3例正常瘢痕组织共44,463个细胞进行了分析，构建了细胞图谱并重点解析了成纤维细胞的异质性。其次，整合了来自公共数据库（SAR、GSE113619等）的转录组测序数据，包括37例瘢痕疙瘩和27例健康皮肤样本，用于识别与临床诊断相关的差异表达基因。通过轨迹分析（Monocle 2）和共识聚类（ConsensusClusterPlus）等生物信息学方法，构建了基于成纤维细胞分化相关基因（DEFDRGs）的分子分型系统。此外，研究还利用免疫组织化学（IHC）和RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）技术，在19例临床瘢痕疙瘩样本中对关键分子标志物进行了验证。

研究结果

单细胞图谱揭示瘢痕疙瘩中的优势细胞组成

通过对44,463个单细胞的分析，研究将细胞分为9种主要类型，其中内皮细胞和成纤维细胞在所有样本中占主导地位。细胞通讯分析显示，成纤维细胞是所有细胞类型中主要的相互作用者，在瘢痕疙瘩中表现出比正常瘢痕组织更强的全局通讯活性，提示其在疾病发生中扮演着核心枢纽角色。

单细胞分析揭示瘢痕疙瘩中成纤维细胞的异质性

研究人员从数据集中提取了13,925个成纤维细胞，并将其进一步分为6个不同的亚群。其中，成纤维细胞3在瘢痕疙瘩中占主导地位，并高表达POSTN、ASPN和COMP等与瘢痕形成相关的基因。细胞通讯分析表明，成纤维细胞3与其他亚型之间的相互作用最为频繁，COL1A1和COL1A2是关键的细胞间关联基因。

轨迹分析解码瘢痕疙瘩成纤维细胞的分化命运和表达动态

为了描绘瘢痕疙瘩成纤维细胞的分化层次，研究利用Monocle 2进行了单细胞拟时序排序分析，重建了成纤维细胞的谱系轨迹，揭示了7个不同的细胞状态。成纤维细胞3主要占据中间至晚期的拟时序位置。通过该分析，研究识别了与成纤维细胞分化相关的基因（FDRGs）。

整合轨迹-临床分析识别瘢痕疙瘩成纤维细胞中的核心命运决定调控因子

通过整合单细胞轨迹分析中识别的FDRGs和转录组测序数据中与临床诊断相关的差异表达基因，研究最终确定了25个核心的、具有临床相关性的成纤维细胞分化相关基因（DEFDRGs）。这些基因不仅决定了细胞命运，还与瘢痕疙瘩的临床诊断密切相关。

基于DEFDRGs构建基于成纤维细胞分化的瘢痕疙瘩分类（FDBKC）

基于25个DEFDRGs的表达谱，研究通过共识聚类分析，将患者分为三个分子亚型，并命名为：低成纤维细胞分化分类（LFDC）、中成纤维细胞分化分类（MFDC）和高成纤维细胞分化分类（HFDC）。该分型系统与瘢痕疙瘩的诊断和病程时间显著相关，其中HFDC亚型与更严重的病理状态相关。

FDBKC的免疫浸润特征

免疫浸润分析显示，高、低风险组之间的免疫细胞浸润模式差异不大，这与之前的研究发现不一致。这种差异可能归因于样本量有限和个体差异。

识别转录组测序中的差异表达基因、差异表达转录因子和信号通路

在转录组测序分析中，研究识别了1828个差异表达基因（DEGs），并筛选出4个差异表达转录因子（DETFs）：HOXC9、LMO2、PDX1和RUNX1。基因集变异分析（GSVA）揭示了不同样本中Hallmark信号通路的富集情况。

DEFDRGs表现出显著的临床相关性

通过主成分分析（PCA）和LASSO回归，研究建立了一个多变量逻辑回归模型，并提取了11个关键的DEFDRGs用于后续分析。临床相关性分析显示，风险评分与年龄、性别、诊断和时间相关。该模型在训练集和测试集中均表现出优异的预测价值，曲线下面积（AUC）分别为0.995和0.868。

构建FDBKC的调控网络并识别相应的特异性药物

研究为FDBKC的每个亚型构建了以DEFDRGs为中心的调控网络，整合了上游DETFs、下游信号通路和免疫细胞/功能的调控潜力。RUNX1是所有亚型中共同的转录因子，表明其在瘢痕疙瘩形成中可能发挥关键作用。此外，通过连接图谱（CMap）分析，研究为每个FDBKC亚型识别了潜在的治疗小分子药物。

不同临床亚型瘢痕疙瘩的病理表现

在19例临床瘢痕疙瘩样本中，IHC验证结果显示，LFDC组MMP1表达最高，MFDC组FOXC2表达最高，而HFDC组KLK6和TPSB2表达最高。临床表型分析表明，HFDC亚型患者的温哥华瘢痕量表（VSS）评分、瘢痕厚度、硬度以及疼痛和瘙痒的发生率均显著高于其他亚型，反映了更严重的临床病理表现。

研究结论与讨论

本研究通过整合单细胞和转录组测序数据，首次构建了一个基于成纤维细胞分化状态的瘢痕疙瘩分子分型系统（FDBKC）。该系统将患者分为LFDC、MFDC和HFDC三个亚型，其中HFDC亚型与更严重的临床病理表型相关，表现为更高的VSS评分、更厚的瘢痕、更硬的质地以及更高的疼痛和瘙痒发生率。

研究揭示了不同亚型的关键分子特征：LFDC亚型以MMP1和F13A1高表达为特征，这些基因可能通过降解细胞外基质（ECM）和调节凝血过程发挥保护作用；MFDC亚型以MDK和FOXC2高表达为特征，这些基因在血管生成和上皮-间质转化（EMT）中发挥双重作用；HFDC亚型以KLK6和TPSB2高表达为特征，这两个基因分别作为炎症和纤维化的关键驱动因子，通过激活蛋白酶激活受体（PARs）和TGF-β信号通路，促进炎症反应和胶原合成，从而驱动瘢痕疙瘩的恶性进展。

此外，研究还识别了RUNX1作为所有亚型中共同的转录因子，提示其在瘢痕疙瘩纤维化中可能扮演着至关重要的角色。通过CMap分析，研究为每个亚型预测了潜在的治疗药物，例如，强心苷类药物Ouabain被预测为HFDC亚型的潜在抑制剂，其抗纤维化作用已在其他疾病模型中得到验证。

总之，该研究不仅阐明了成纤维细胞分化在瘢痕疙瘩发病机制中的作用，还建立了一个具有临床转化潜力的分子分型系统，为瘢痕疙瘩的精准诊断、预后评估和靶向治疗提供了新的理论依据和策略。