尿液细胞游离DNA片段化与完整性分析：膀胱癌无创诊断与分期的创新生物标志物研究

本研究创新性地分析尿液细胞游离DNA（cfDNA）的片段化模式与完整性，通过量化ACTB、AR、MYC等基因大片段（>250bp）与嵌套小片段（<125bp）的比值，发现其可作为膀胱癌（BC）诊断与分期的新型非侵入性生物标志物，尤其对肌层浸润性膀胱癌（MIBC）具有高特异性（97%）与敏感性（70%），有望替代传统侵入性检测方法。

亮点

尿液细胞游离DNA（cfDNA）片段化与完整性分析为膀胱癌（BC）的诊断和分期提供了非侵入性解决方案。通过量化特定基因（如ACTB、AR、MYC）的大片段与小片段比值，本研究揭示了其在区分非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC）方面的潜力，为临床实践提供了创新工具。

引言

膀胱癌（BC）是全球第9^th大常见癌症，年癌症死亡率排名第13^th（数据来源：https://gco.iarc.fr/en[2024年12月最后访问]）。2022年，BC年新增病例614,298例，导致220,596人死亡，占成人恶性肿瘤的3%，是最致命的泌尿系统恶性肿瘤。

目前，膀胱超声、细胞学和膀胱镜检查是BC检测和随访的金标准。办公室柔性膀胱镜虽可减少不适，但仍具侵入性，且费用高昂、依赖操作者经验。尿液细胞学特异性高（>90%），但敏感性低（40-50%），尤其对低级别肿瘤。因此，开发非侵入性、高性价比的生物标志物至关重要。

研究对象

2016年5月至2018年4月期间，在拉菲大学理工学院医院（西班牙瓦伦西亚）招募了156名不同分期的BC患者和79名对照。对照按年龄、性别和地理分布与病例匹配，均为因非恶性疾病（如膀胱炎、良性前列腺增生）接受检查的泌尿科患者。

尿液cfDNA浓度定量

使用Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒（ThermoFisher）在Fluoroskan Ascent荧光仪上重复测量尿液cfDNA浓度，通过λ DNA标准曲线插值计算。

尿液cfDNA提取

所有样本均同等处理以避免cfDNA降解[32]，且未经历冻融循环。评估了5种提取试剂盒：QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）、NucleoSpin Virus（Macherey-Nagel）、Norgen Urine Cell-Free DNA Purification Midi Kit（Norgen Biotek）、Quick-DNA Urine Kit（Zymo Research）和QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen），最终选择QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（详见方法部分）。

研究对象的临床特征

所有BC患者均诊断为移行细胞癌（尿路上皮癌）。6例呈现变异组织学特征（如肉瘤样、鳞状分化、淋巴上皮瘤样），均属尿路上皮癌谱系。非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）病例的组织样本中均存在肌层且无肿瘤浸润。

研究对象的临床特征如表2所示。由于BC发病率男性更高（约4:1），本队列中男性占比高（病例80.1%，对照79.7%）。病例和对照的中位年龄均为72岁。病例中，55.1%为NMIBC（pTa-pT1），44.9%为MIBC（≥pT2）。大多数NMIBC为高级别（70.2%），而MIBC中86.8%为高级别。19.9%的病例有BC病史。

讨论

液体活检最初仅限于血液，现已扩展到尿液、唾液和脑脊液（CSF）等多种体液。每种液体提供独特的癌症洞察。这类活检正成为BC诊断和管理的重要工具，主要通过分析循环肿瘤DNA（ctDNA），但该方法面临重要局限，如需对肿瘤和循环DNA进行测序以匹配突变，从而增加成本。近年来，循环cfDNA片段组学及其完整性分析通过实时定量PCR（qPCR）等无需测序的方法，为癌症检测提供了新途径。

作者贡献

研究概念与设计：J.O.和P.M.；数据获取：R.H、J.P.-A.、P.V.、M.M.-S.和C.D.V.-D.；数据分析与解释：R.H.、J.O.和P.M.；手稿起草：R.H.和P.M.；对重要知识内容的手稿批判性修订：J.O.、E.P.、M.M.-S.和C.D.V.-D.；统计分析：R.H.和P.M.；资金获取：E.P.和P.M.；行政、技术或材料支持：无；监督：Medina；其他：无。

P.M.是本研究保证人。

致谢

感谢María José Solmoirago、Fernando Cana和Noelia Santillana在多个实验中的技术帮助；感谢IIS La Fe数据科学、生物统计学和生物信息学单元的Antonio J. Ca?ada-Martínez在统计分析方面的支持；感谢病理科的David Ramos的指导和协助；同时感谢Paula Herranz Gómez为图形摘要设计并创作插图。