铜死亡（Cuproptosis）在骨关节炎中的作用：探索软骨细胞铜死亡及治疗新途径

本研究针对骨关节炎（OA）中软骨细胞死亡机制不清的问题，聚焦新发现的细胞死亡方式——铜死亡（cuproptosis），通过临床样本、动物模型和细胞实验系统验证了软骨细胞铜死亡在OA发生发展中的关键作用，并证明铜离子螯合剂四硫钼酸铵（TTM）可通过促进谷胱甘肽（GSH）表达有效延缓OA进展，为OA治疗提供了新靶点和治疗策略。

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种常见的退行性关节疾病，全球约有2.5亿患者，随着人口老龄化加剧，患者数量持续上升，给社会带来沉重的经济负担。OA的发病机制复杂，其中软骨退变是核心环节，而软骨细胞死亡是导致软骨退变的关键机制之一。以往研究主要集中在凋亡、焦亡和自噬等传统细胞死亡方式，近年来铁死亡和坏死性凋亡等新型细胞死亡方式的发现丰富了人们对OA病理机制的认识，但仍未能完全阐明OA的发病机制。2022年3月，哈佛大学Tsvetkov教授在《Science》杂志报道了一种铜诱导的细胞死亡机制，并将其命名为铜死亡（cuproptosis）。这是一种铜离子依赖的程序性细胞死亡方式，其特征是铜离子靶向结合细胞三羧酸循环中的脂酰化组分，导致脂酰化蛋白聚集和铁硫簇蛋白减少，引发蛋白毒性应激反应最终导致细胞死亡。

以往研究发现，膝OA患者滑液和关节软骨中的铜离子水平与OA严重程度相关，关节软骨磨损越严重，滑液和关节软骨中的铜离子水平越高。然而，铜死亡在OA进展中的作用尚未有研究探讨。为此，来自浙江中医药大学附属第一医院骨科创伤研究所的研究团队开展了这项研究，旨在探索软骨细胞铜死亡与OA的关系，并评估铜离子螯合剂四硫钼酸铵（TTM）在OA治疗中的潜力。研究成果发表在《Journal of Orthopaedic Translation》上。

研究人员采用多学科技术方法开展研究，主要包括：收集OA患者全膝关节置换术中的临床软骨样本和小鼠动物标本；使用Micro-CT、组织病理学染色、免疫组化和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）评估OA进展中软骨细胞铜死亡的发生；在体外使用elesclomol和硫酸铜构建小鼠软骨细胞铜死亡模型；通过ICP-MS、CCK-8等技术探索铜死亡在OA发展中的作用；评估TTM缓解软骨细胞铜死亡和延缓OA进展的效果；采用代谢组学预测TTM改善OA的潜在通路；运用分子对接预测TTM的干预靶点；通过si-谷胱甘肽合成酶（si-GSS）质粒敲低和外源性GSH补充研究谷胱甘肽（GSH）对软骨细胞铜死亡和OA发展的影响。

3.1. OA的发生与软骨细胞铜死亡相关

通过对OA患者胫骨平台软骨样本的分析，研究发现退化区域的软骨表现出更明显的磨损，硫酸盐糖胺聚糖丢失和软骨钙化，OARSI评分升高。ICP-MS检测显示退化区域铜离子含量显著增加。免疫组化分析发现退化区域MMP13表达增加，Col2a1表达减少，铜死亡相关蛋白DLAT、DLST和FDX1低表达，而热休克蛋白HSP70高表达。在小鼠DMM模型中也观察到类似现象：软骨基质丢失和钙化，骨赘形成，软骨下骨硬化，骨增生，以及铜死亡相关蛋白表达异常。体外实验进一步证实，elesclomol和硫酸铜联合干预可导致软骨细胞活力下降，细胞内铜离子含量增加，软骨基质代谢失衡，铜死亡相关蛋白表达异常，线粒体膜电位降低，细胞凋亡增加，线粒体形态损伤和呼吸功能受损。研究人员还排除了自噬和焦亡的参与，证实铜死亡是独立的细胞死亡方式。

3.2. TTM减轻软骨细胞铜死亡并延缓OA进展

研究发现TTM干预以剂量依赖方式改善elesclomol和硫酸铜联合干预引起的细胞活力和数量减少。ICP-MS检测显示TTM逆转了模型组细胞内铜离子浓度的增加。qPCR和Western blotting实验表明TTM逆转了软骨基质代谢失衡，增加了DLAT、DLST和FDX1的表达，降低了HSP70的表达。线粒体膜电位测量显示TTM逆转了elesclomol和硫酸铜引起的线粒体膜电位降低。流式细胞术显示TTM以剂量依赖方式减少细胞凋亡。透射电镜和线粒体应激测试表明TTM保护了线粒体的正常形态和呼吸功能。这些结果表明TTM通过改善软骨细胞铜死亡延缓OA进展。

3.3. TTM改善软骨细胞铜死亡并延缓小鼠OA进展

体内实验显示，TTM关节腔注射减轻了DMM小鼠的OA表型：Micro-CT结果显示TTM减轻了骨赘形成、软骨下骨硬化、骨体积分数、骨矿物质密度、骨小梁密度和骨小梁厚度的增加，以及骨小梁分离度的减少。 Safranin O-Fast Green染色和ABH染色显示TTM改善了硫酸盐糖胺聚糖的丢失、软骨表面退化和OARSI评分。免疫组化结果显示TTM显著改善了异常软骨基质代谢，增加了DLAT、DLST和FDX1的表达，降低了HSP70的表达。步态分析显示TTM有效缓解了DMM小鼠的疼痛和步态异常。

3.4. 软骨细胞的代谢组学分析和TTM假定治疗靶点的分子对接分析

靶向代谢组学分析发现，elesclomol和硫酸铜联合干预后，模型组GSH表达显著降低，而TTM治疗可恢复GSH的表达。分子对接结果显示TTM与GSS（谷胱甘肽合成酶）发生特异性结合，表明GSH可能是TTM缓解软骨细胞铜死亡治疗OA的治疗靶点。

3.5. TTM通过增加GSH表达改善软骨细胞铜死亡并延缓OA进展

为进一步阐明TTM缓解软骨细胞铜死亡和延缓OA的确切机制，研究人员通过shRNA敲低GSS。结果显示GSS敲低显著抑制了TTM的治疗效果：与阴性对照组相比，GSS敲低组细胞活力和数量减少，凋亡增加，细胞内铜离子含量增加。外源性GSH补充改善了elesclomol和硫酸铜引起的细胞活力、数量减少、凋亡增加和细胞内铜离子含量增加。qPCR和Western blotting实验表明，GSS敲低削弱了TTM对异常软骨基质代谢的调节作用，而外源性GSH补充具有与TTM相似的效果。透射电镜和线粒体膜电位测量显示GSS敲低组线粒体膜电位降低，形态萎缩，外膜破裂，完整性受损，而外源性GSH补充赋予线粒体细胞对铜死亡的抵抗能力。流式细胞术结果显示GSS敲低降低了TTM挽救软骨细胞凋亡的效果，而外源性GSH补充改善了软骨细胞凋亡。线粒体应激测试显示GSS敲低降低了TTM改善线粒体呼吸水平的效果，外源性GSH补充也能改善线粒体呼吸。细胞内ROS水平评估表明外源性谷胱甘肽补充显著减弱了细胞内ROS的产生。这些结果表明TTM通过增加GSH表达改善软骨细胞铜死亡并延缓OA进展。

研究结论表明，软骨细胞铜死亡在膝OA的发生和发展中起关键作用，铜离子螯合剂TTM通过缓解软骨细胞铜死亡能够治疗膝OA。TTM通过促进GSH表达增强软骨细胞对铜死亡的抵抗能力，从而改善OA表型。具体机制包括：TTM作为铜离子螯合剂，能够清除生物可利用的自由Cu²⁺；TTM激活NRF2-Keap1信号通路，增强软骨细胞内GSH合成，实现未结合铜的内源性螯合；TTM抑制巨噬细胞中NLRP3炎症小体激活，并将促炎M1表型重编程为修复性M2表型，从而调节炎症级联反应。

这项研究的重要意义在于首次系统证实了软骨细胞铜死亡在OA进展中的关键作用，发现了TTM通过促进GSH表达缓解软骨细胞铜死亡的治疗潜力，为OA治疗提供了新的靶点和策略。TTM作为FDA批准的治疗Wilson病的药物，具有广泛的临床数据，为其在OA治疗中的重新应用提供了重要的参考价值。未来研究应聚焦于开发先进制剂，包括功能化纳米胶束和刺激响应水凝胶，利用纳米技术和生物材料工程提高治疗精度和持续疗效。