碱基编辑通用型CAR-T细胞联合靶向治疗急性髓系白血病的突破性研究

本研究针对急性髓系白血病(AML)抗原异质性高、缺乏特异性靶点等治疗难题，开发了多重碱基编辑的"通用型"抗CD33、CLL-1和CD7的CAR-T细胞(BE-CAR)。研究证实BE-CAR单药治疗可有效清除同质抗原AML，而BE-CAR33与BE-CARCLL-1联合应用能显著抑制异质性CD33+/-CLL-1+/-AML，且CD7敲除使BE-CAR33/BE-CARCLL-1与BE-CAR7联用成为可能。这种按患者抗原谱"挑选混合"的通用型CAR-T策略为AML免疫治疗提供了新方向，并为allo-SCT前深度减瘤创造了条件。

急性髓系白血病(AML)是一种极具侵袭性的血液系统恶性肿瘤，患者长期生存率极低，治疗选择有限。尽管嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在B细胞恶性肿瘤中取得了显著成功，但在AML中的应用却面临巨大挑战。这主要源于AML细胞的高度异质性——不同患者之间甚至同一患者体内的白血病细胞表达的抗原谱都存在显著差异，使得针对单一抗原的治疗往往无法覆盖所有肿瘤细胞群体。

更棘手的是，大多数AML相关抗原(如CD33、CLL-1、CD123、CD7等)同时也表达在正常造血细胞上，导致CAR-T细胞在攻击肿瘤的同时也会损伤健康组织，造成严重的骨髓抑制和免疫缺陷。为了解决这一难题，研究人员将目光投向了基因编辑技术，特别是碱基编辑(base editing)这一新兴技术，希望能够创建出更安全、更有效的"通用型"CAR-T细胞产品。

在这项发表于《Leukemia》的重要研究中，研究团队开发了多重碱基编辑的"通用型"CAR-T细胞策略，针对AML中三个关键靶点——CD33、CLL-1和CD7，分别构建了BE-CAR33、BE-CARCLL-1和BE-CAR7细胞产品。这些经过编辑的CAR-T细胞不仅能够有效识别并攻击表达相应抗原的AML细胞，还通过基因编辑消除了T细胞受体(TCRαβ)表达以防止移植物抗宿主病(GvHD)，去除了CD7抗原以避免CAR-T细胞间的自相残杀( fratricide)，同时还敲除了CD52基因使其能够抵抗淋巴清除抗体Alemtuzumab的作用。

研究过程中，团队运用了几项关键技术：通过慢病毒载体系统构建表达不同CAR的T细胞；使用碱基编辑器coBE3和特异性sgRNA实现TRBC、CD7和CD52基因的多重敲除；采用流式细胞术和⁵¹Cr释放实验评估CAR-T细胞的体外细胞毒性；建立免疫缺陷(NSG)小鼠模型和人源化AML异种移植模型进行体内功效验证；利用患者来源异种移植(PDX)模型评估联合治疗策略的效果。这些技术的综合应用为研究的顺利开展提供了坚实保障。

BE-CAR T细胞的生成与表征

研究人员通过不同的制造策略生成了三种BE-CAR产品。对于BE-CAR7，先进行碱基编辑操作敲除TRBC、CD7和CD52基因，然后再导入CAR7载体；而对于BE-CAR33和BE-CARCLL-1，则先进行CAR转导，再进行编辑操作。这种方法使得BE-CAR33和BE-CARCLL-1产品的CAR阳性率高达90%以上，而残余TCRαβ表达均低于2%。分子水平分析显示，在TRBC、CD7和CD52位点均实现了高效率的靶向碱基转换，证实了编辑操作的有效性。

BE-CAR T细胞对抗同质抗原AML的功能

体外实验证实，三种BE-CAR产品均能特异性裂解表达相应抗原的AML细胞系(如Kasumi-3、HL-60、MOLM-14和U-937)和原代AML样本，并分泌大量细胞因子。在免疫缺陷小鼠模型中，每种BE-CAR单药治疗均能显著抑制AML进展：BE-CAR7有效清除CD7Kasumi-3细胞；BE-CAR33和BE-CARCLL-1则能控制HL-60细胞的生长。治疗后小鼠骨髓中几乎检测不到残留白血病细胞，同时能检测到持续存在的CAR-T细胞，证明这些工程化细胞具有良好的抗肿瘤活性和体内持久性。

BE-CAR33和BE-CARCLL-1 T细胞对抗异质性AML

为模拟临床AML的抗原异质性，研究人员通过CRISPR/Cas9技术构建了CD33+CLL-1和CD33CLL-1+的HL-60变异细胞系。当将这些异质性细胞混合后移植到小鼠体内时，单药治疗组(BE-CAR33或BE-CARCLL-1单独使用)虽然能清除表达对应抗原的疾病，但无法控制抗原阴性细胞的生长，最终导致治疗失败。而联合使用BE-CAR33和BE-CARCLL-1细胞的小鼠则表现出显著的疾病控制效果，骨髓中几乎检测不到残留白血病细胞，证明联合靶向策略能有效应对AML的异质性挑战。

BE-CAR7对BE-CAR33或BE-CARCLL-1效应细胞的 fratricide活性的规避

研究人员进一步探索了将BE-CAR7与其他BE-CAR产品联合使用的可能性。由于BE-CAR7能识别并杀伤表达CD7的细胞，而常规CAR-T细胞通常表达CD7，因此存在自相残杀的风险。通过碱基编辑去除BE-CAR33和BE-CARCLL-1细胞的CD7表达，这些细胞成功规避了BE-CAR7的攻击。在PDX模型中，CD7编辑的BE-CAR33细胞即使在BE-CAR7细胞存在的情况下，仍能保持其抗白血病活性，显著延长小鼠生存期，证明这种联合策略的可行性。

研究结论与意义

本研究成功开发了多重碱基编辑的通用型CAR-T细胞平台，能够同时靶向AML的多个关键抗原。研究证明，单药BE-CAR治疗对同质抗原表达的AML有效，而对于高度异质性的AML，则需要根据患者特定的抗原谱"挑选混合"相应的BE-CAR产品进行联合治疗。特别重要的是，通过碱基编辑去除共享抗原CD7，使得BE-CAR7能够与其他BE-CAR产品安全联用，这不仅提供了额外的抗白血病活性，还能发挥淋巴清除作用，为后续异基因造血干细胞移植(allo-SCT)创造条件。

这种通用型BE-CAR策略具有多重优势：首先，"现货型"特性使其能够快速应用于急需治疗的患者，避免了自体CAR-T细胞制备周期长的问题；其次，多重基因编辑设计大大提高了治疗安全性，减少了GvHD和细胞间自相残杀的风险；最后，模块化的组合方式允许临床医生根据患者具体的抗原表达情况个性化地选择CAR-T产品组合，实现精准治疗。

该研究为AML的免疫治疗提供了新的思路和策略，特别是针对那些传统治疗效果差、具有高度异质性的难治性病例。这种基于碱基编辑的通用型CAR-T平台不仅有望改善AML患者的预后，还可能应用于其他血液系统恶性肿瘤的治疗，代表着肿瘤免疫治疗领域的一个重要发展方向。未来，随着更多靶点的开发和优化，这种"按需组合"的治疗模式有望成为恶性肿瘤治疗的新范式。