《Journal of Oral Biosciences》：Molecular mechanism of NF-κB-mediated transcriptional activation of MMP12 in lipopolysaccharide-stimulated human dental pulp stem cells
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本研究通过LPS刺激人牙髓干细胞模型，揭示NF-κB信号通路通过调控MMP12启动子促进炎症反应的机制，证实MMP12是龋齿炎组织破坏的关键介质，并提出其作为治疗靶点的潜力。
肖一舒|宋志|曾德荣|杨玉红|彭伟琦|林巧珍|黄云|柴文祥|李永辉|赵秀
深圳大学医学院附属深圳大学总医院中央实验室，中国广东省深圳市518000
摘要
目的
研究基质金属蛋白酶（MMP）12在牙髓炎中加剧炎症的分子机制，并探讨脂多糖（LPS）诱导的MMP12表达与核因子-κB（NF-κB）信号通路激活之间的潜在调控轴。
方法
使用LPS刺激的人类牙髓干细胞（hDPSCs）建立了牙髓炎模型。通过RNA测序分析生理状态和炎症状态之间的差异表达基因，并通过定量实时PCR（qPCR）进行验证。通过Western blotting和qPCR检测NF-κB通路对MMP12和细胞因子表达的调控作用。此外，还采用双荧光素酶报告基因检测方法确认MMP12启动子区域内的NF-κB结合位点。
结果
LPS（1 μg/mL）处理可触发hDPSCs的炎症激活。六个与牙髓炎相关的基因：MMP12、IL6、IL8、IL10、IL1β和TNF-α显著上调（P < 0.05）。抑制NF-κB可显著降低MMP12的表达。此外，发现NF-κB通过位于上游-1590/?1600 bp位置的结合位点转录激活MMP12启动子，从而建立了NF-κB/MMP12信号通路。
结论
NF-κB/MMP12通路在牙髓炎中作为炎症的关键放大器发挥作用。数据表明MMP12是牙髓组织破坏的主要介质，是一个潜在的治疗靶点，突显了疾病进展背后的协调机制。
引言
牙髓炎是一种常见的牙髓炎症性疾病，由革兰氏阴性细菌产生的脂多糖（LPS）引发，会在牙髓组织中触发强烈的炎症级联反应[1,2]。人类牙髓干细胞（hDPSCs）具有克隆能力、可塑性粘附性和多能性（可分化为牙源性、成骨性、脂肪生成性和软骨生成性细胞系），是牙髓生物学研究的重要模型[[3], [4], [5]]。基质金属蛋白酶（MMPs）是多种病理过程（包括炎症[6]）的关键调节因子。其中，MMP12是一种由巨噬细胞产生的弹性蛋白酶，编码于11q22.3染色体上，已被证实是肺气肿和关节炎等炎症性疾病的关键介质[[7], [8], [9]]。新兴证据表明MMP12也参与了口腔疾病的发生，使其成为早期诊断和预后评估的宝贵指标，以及潜在的治疗干预分子靶点[6]。迄今为止，MMP12已被发现与牙周病[10], [11], [12], [13]、正畸牙齿移动[14,15]、颞下颌关节功能障碍（TMD）和口腔鳞状细胞癌（OSCC）[16], [17], [18]有关。然而，其在牙髓炎症中的具体作用仍大部分未被探索。值得注意的是，MMP12的敲低可以抑制巨噬细胞中的促炎细胞因子产生[19]。同样，LPS刺激的牙髓细胞表现出白细胞介素-1β、IL6、IL8和IL10的上调，这些因子被认为是牙髓炎发病机制中的关键介质[20]。
尽管取得了这些进展，但MMP12介导的细胞因子调控的信号机制仍不明确。为填补这一空白，我们系统地分析了内odontic干细胞在生理和炎症条件下的MMP12表达动态，并绘制了相关信号网络。本研究提供了实验证据，支持MMP12在牙髓组织破坏中的病理作用，并强调了其作为牙髓炎干预治疗靶点的潜力。
部分摘录
牙髓干细胞培养与特性
本研究获得了深圳大学总医院伦理委员会的批准（批准号：KYLL-2022K-0105）。在获得知情同意后，从健康捐赠者的拔牙中分离出hDPSCs（深圳大学总医院口腔科）。hDPSCs的来源和实验分配见S1表。提取的牙齿用70%（v/v）乙醇表面消毒2分钟，然后用无菌磷酸盐缓冲液冲洗三次
hDPSCs的间充质干细胞特性
在培养3-7天后，从提取的牙髓组织中观察到原代细胞增殖。粘附细胞表现出可塑性粘附性和典型的纺锤形形态（图1A和B）。流式细胞术分析显示hDPSCs中间充质干细胞标志物CD90（89.21%）和CD29（94.41%）的高表达，而造血谱系标志物CD45（1.19%）和CD34（0.53%）的表达较低（图1C）。
讨论
牙髓炎是一种主要由龋齿、外伤或反复的修复程序引起的牙髓组织炎症性疾病[21]。本研究使用LPS刺激的hDPSCs建立了该模型。LPS作为一种典型的病原体相关分子模式（PAMP），与hDPSCs上的Toll样受体4（TLR4）结合，从而启动NF-κB和MAPK信号通路，驱动促炎细胞因子的产生[22]。该模型的有效性还得到了单细胞分析结果的支持
结论
总之，本研究阐明了NF-κB→MMP12信号通路作为牙髓炎症反应的关键放大器的作用。hDPSCs中NF-κB驱动的MMP12转录调控扩展了我们对牙髓炎的机制理解，超出了以巨噬细胞为中心的模型。临床研究表明，OSCC患者唾液中的MMP12水平高于健康个体和良性口腔病变患者，这突显了其作为早期口腔恶性肿瘤筛查的非侵入性生物标志物的潜力[6]
伦理批准
本研究获得了深圳大学总医院研究伦理委员会的批准（KYLL-2022K-0105）。
利益冲突
作者声明与本研究的研究、作者身份和文章发表无关的利益冲突。
作者贡献声明
肖一舒：撰写原始稿件、数据可视化、软件使用、方法学设计、概念构建。宋志：撰写原始稿件、数据可视化、软件使用、方法学设计、概念构建。曾德荣：数据可视化、监督、方法学设计、实验研究。杨玉红：数据可视化、监督、方法学设计、实验研究。彭伟琦：数据可视化、监督、方法学设计、实验研究。林巧珍：数据可视化、监督、方法学设计、实验研究。
资助
本研究得到了以下机构的资助：国家自然科学基金（82070161）、广东省自然科学基金（2024A1515010587, 2022A1515012465）、深圳市科技创新委员会自然科学基金（JCYJ20220531103003007）、深圳市科技创新委员会（20220810173216001）、深圳市重点实验室基金（ZDSYS20200811143757022）以及深圳大学医学Plus项目（2023YG005）。
