实验性膜蛋白结构生物学的挑战与突破：从表达瓶颈到技术革新

本综述系统梳理了膜蛋白结构生物学的发展历程，重点剖析了从蛋白表达、纯化到结构解析（X-ray crystallography、cryo-EM、MicroED）的关键技术瓶颈与突破，展望了原位结构解析与AI预测等前沿方向，为膜蛋白功能机制研究提供重要参考。

　　

Highlight

本综述追溯了膜蛋白结构生物学的发展历程，系统阐述了该领域从蛋白表达、纯化到结构解析技术（X射线晶体学、冷冻电镜cryo-EM、微晶电子衍射MicroED）的重大突破，并展望了原位结构解析与AI驱动结构预测等前沿方向。

Introduction: The challenge of membrane protein structural biology

实验性膜蛋白结构生物学领域（即理解膜蛋白的结构-功能关系）始终兼具振奋人心与充满挑战的特质。整合膜蛋白作为细胞的重要组成部分，其疏水区域嵌入细胞膜中，亲水区域暴露于水相环境，构成孔道、通道和受体（图1a）。这些...

Origins and early pioneers: Learning from native sources

膜蛋白结构生物学一直被视为一项巨大挑战，主要源于膜蛋白在其天然宿主生物中的典型低丰度特性，这导致RCSB-PDB数据库中膜蛋白结构占比不足3%。在2000年之前，该领域还受限于膜蛋白表达系统的缺乏，仅能依赖天然来源中丰度高且稳定的蛋白质...

From scarcity to scale: Overcoming expression and yield barriers

膜蛋白结构生物学的核心难题在于产量问题——即膜蛋白固有的低表达水平以及脱离天然膜环境后的溶解性差或不稳定性，这至今仍是瓶颈。此外，许多膜蛋白在异源表达系统中过度表达时具有毒性，或无法正确折叠和行使功能。为克服这些障碍，该领域逐步摆脱对天然来源的依赖...

Membrane extraction and protein purification

膜蛋白的提取与纯化仍是结构生物学中至关重要且技术难度高的环节，需要精细优化以维持蛋白质在膜外环境中的稳定性与功能。在简化去垢剂筛选（膜蛋白溶解的关键步骤）方面的一项重要进展是利用GFP融合蛋白与荧光尺寸排阻色谱技术，可直接从细胞裂解液中快速进行小规模溶解蛋白评估...

X-ray crystallography in membrane proteins and developments

自1990年代中期以来，X射线晶体学一直是膜蛋白结构解析中最广泛使用的工具，在推进我们理解其结构与功能方面发挥了奠基性作用。然而，获得适用于X射线晶体学结构解析的、具有良好衍射质量的适当尺寸晶体，要求膜蛋白在去垢剂中呈单分散状态，并通过动力学与热力学途径形成稳定晶体...

Cryogenic-electron microscopy (cryo-EM)

早在1980年代末期，对嵌入膜片中的细菌视紫红质二维晶体阵列进行的电子显微镜研究，就已显示出冷冻电镜（cryo-EM）在膜蛋白研究中的显著优势。但CCD相机的技术限制使单颗粒冷冻电镜领域发展缓慢多年，膜蛋白结构在蛋白质数据库（PDB）中的占比不足1%...

High resolution electron diffraction (ED)

高分辨率电子衍射历来是膜蛋白结构生物学的重要组成部分，现已通过将晶体学与电子显微镜技术相结合，发展成为强大的混合方法——微晶电子衍射（MicroED）。早在对紫色膜蛋白（细菌视紫红质）开展的扩展性先驱工作中，电子衍射已展现出提供原子分辨率信息的潜力...

Conclusion

（此处按指令要求截止翻译）