CIRI3：突破环形RNA检测瓶颈，实现海量RNA测序数据的高效精准分析

本研究针对环形RNA（circRNA）检测工具在大规模RNA测序数据中存在的计算效率低、准确性不足等问题，开发了新一代算法CIRI3。该工具通过动态多线程任务分区和阻断搜索策略，将运行速度提升一个数量级，同时显著提高检测精度。研究人员应用CIRI3分析了2,535个癌症相关样本，构建了环形RNA生物标志物网络和预训练模型，为癌症诊断和circRNA功能研究提供了重要资源。

　　

环形RNA（circular RNAs, circRNAs）是一类具有共价闭合环状结构的非编码RNA分子，近年来被发现参与多种细胞过程调控，包括信号通路调节、miRNA和RNA结合蛋白的隔离、基因转录启动、mRNA翻译抑制以及蛋白质降解促进等。随着RNA测序（RNA-seq）技术的快速发展，大规模RNA-seq数据集迅速积累，为circRNA研究提供了前所未有的机遇。然而，当前circRNA检测方法在面对海量数据时存在明显局限性——计算效率低下、内存需求巨大，且由于circRNA相对于mRNA的低丰度特性以及不同RNA-seq队列间的强批次效应，其准确量化仍然面临挑战。

为了突破这些技术瓶颈，研究团队开发了CIRI3这一专门用于大规模circRNA检测和表征的工具。作为CIRI系列工具的新成员，CCIRI3针对多样本比对结果进行了优化，在量化准确性、运行效率和内存使用方面都有显著提升。其创新之处包括 robust identification of intronic self-ligated circRNAs（内含子自连接环形RNA的稳健识别）和针对用户定义circRNA列表的靶向量化功能。

在技术方法上，研究人员使用BWA或STAR比对器处理RNA-seq数据，采用动态多线程任务分区策略优化计算资源分配，运用阻断搜索方法和多种子匹配与最大似然估计（MLE）相结合的方式恢复junction reads，并通过Smith-Waterman局部序列比对提高分类准确性。团队收集了2,535个人类癌症和正常组织样本的总RNA-seq数据，使用CIRI3算法进行circRNA鉴定，并利用深度学习模型和LightGBM分类器进行癌症分类和生物标志物筛选。

高性能circRNA检测工具的开发

通过与其他五种常用工具（find_circ、KNIFE、CIRCexplorer3、DCC和CIRI2）的比较，CIRI3在Hs68细胞系样本中表现出更高的推定阳性率和更低的假阳性率。虽然CIRI2与CIRI3有大量重叠，但CIRI3独特检测到的109个circRNA中有54个是推定阳性。在所有工具中，CIRI3实现了最高的灵敏度和精确度（F1得分为0.74），并且在每个工具独特检测到的circRNA中，CIRI3检测到的推定阳性最多。

内含子自连接circRNA的发现

CIRI3能够检测到其他短读长工具无法检测到的内含子自连接circRNA。在来自五个物种的肝脏RNA-seq样本中，CIRI3识别出59个此类事件，其中在负鼠中检测到的16个全部在RNase R处理后富集。经RNase R验证的内含子自连接circRNA长度主要在300-800bp之间，90%源自蛋白质编码基因。在前列腺癌队列（n=181）中，CIRI3检测到2,286个内含子自连接circRNA，这些circRNA源自的内含子显著短于未参与circRNA形成的内含子，表明较短的内含子更容易发生反向剪接和circRNA生物合成。

量化准确性的评估

通过分析模拟配对末端RNA-seq数据集（覆盖度20-100x），CIRI3在BSJ读段计数方面的Pearson相关系数（PCC）始终高于0.983，平均为0.990，在所有覆盖水平上都优于其他工具。这种相对于CIRI2（平均PCC为0.954）的改进归因于Smith-Waterman比对的整合，能够恢复CIRI2遗漏的BSJ读段。此外，CIRI3准确量化了FSJ读段和连接点比率，分别实现了0.977和0.980的平均PCC值。在均方根误差（r.m.s.e.）方面，CIRI3在所有覆盖水平上都表现出最低的错误率，进一步证实了其卓越的量化准确性。

计算效率的突破

CIRI3处理2.95亿读段的SW480数据集仅需0.25小时，而其他工具需要2.0-37.1小时（使用25线程），速度慢8-149倍。内存使用方面，CIRCexplorer3、find_circ、DCC、CIRI2和KNIFE分别需要27.7、34.9、50.8、139.2和205.1GB的内存，大大超过了CIRI3所需的12.2GB。在大型数据分析中，CIRI3是唯一能够在24小时内处理4,800亿读段（太字节级别）数据的工具，并且成功处理了来自RNA Atlas的39.2万亿读段（21TB SAM文件），峰值内存使用仅为45.85GB。

BSJ比率作为稳健生物标志物的验证

研究发现，基于BSJ读段计数无法按组织类型区分样本，而circRNA连接点比率则能根据组织来源清晰地对样本进行聚类，且批次效应最小。在肝癌生物标志物研究中，基于连接点比率识别出的差异剪接circRNA与基于读段计数识别出的差异表达circRNA仅有18个重叠，这两组circRNA的宿主基因在 distinct biologically relevant pathways（不同的生物相关通路）中显著富集，表明BSJ比率捕获了一组具有潜在临床相关性的不同circRNA。

CIRIonco数据库的构建与应用

研究人员收集了2,535个总RNA-seq数据，涵盖30种癌症类型，识别出470,641个circRNA，每个样本平均检测到8,245个。结直肠癌（CRC）、三阴性乳腺癌（TNBC）和多形性胶质母细胞瘤（GBM）样本表现出最高数量的circRNA，表明这些癌症类型中存在丰富的circRNA表达。基于此数据集构建的CIRIonco数据库（https://ngdc.cncb.ac.cn/cirionco）与现有circRNA数据库比较，有294,692个circRNA（62.6%）重叠，但CIRIonco独有的BSJ更多位于内含子区域，表明CIRI3在识别这些先前代表性不足的circRNA方面具有高灵敏度。

癌症分类与生物标志物网络

使用癌症和正常样本之间差异剪接的circRNA作为输入特征，训练了一个五层全连接深度神经网络（预训练模型）用于样本分类。该预训练模型在验证集和测试集上都表现良好，总体准确率和AUROC分别超过88%和0.91。在未包含在训练集中的结肠组织样本的泛化测试中，达到了88%的准确率和0.94的AUROC，表明对未见组织类型的强大性能。进一步使用circRNA作为生物标志物，在系统、组织和疾病水平上对癌症样本进行分层，构建了分层树，并使用差异剪接的circRNA作为每个层次的候选标记。LightGBM分类器在系统和组织水平上实现了0.959的平均精确度，在疾病水平上实现了0.974的平均精确度，进一步证明了基于BSJ比率的circRNA作为稳健生物标志物的强大潜力。

本研究开发的CIRI3工具解决了circRNA检测中的多个关键挑战，其可扩展设计使其能够高效处理队列规模的数据，并能够发现缺乏典型GT-AG剪接位点的未被充分探索的circRNA。CIRI3通过提供准确的circRNA识别和量化，促进了多种下游分析。虽然CIRI3并非专门为校正由RNA完整性值变化或circRNA测序方案变异引起的批次效应而设计，但研究表明BSJ比率作为circRNA生物标志物识别具有高可靠性和低可变性。CIRIonco数据库为癌症相关circRNA研究和功能探索提供了广泛且可扩展的资源，为其在癌症分型和精准诊断中的应用奠定了坚实基础。

这项研究的成功不仅提供了circRNA研究的重要工具和资源，更开辟了环形RNA在临床诊断和治疗应用中的新途径，为未来癌症精准医疗提供了新的生物标志物资源和分析框架。