仿生纳米颗粒通过“自上而下与自下而上”双重策略耗竭胆固醇以增强声动力疗法治疗肝细胞癌的效果

本研究针对肝细胞癌(HCC)中胆固醇代谢异常及声动力疗法(SDT)面临的缺氧挑战，构建了HM/ZIF-8@COD/IR820仿生纳米颗粒。该颗粒通过封装胆固醇氧化酶(COD)和声敏剂IR820，并包被杂交细胞膜，实现了肿瘤靶向和pH/超声响应释放。研究证实该颗粒能同时抑制胆固醇合成（“自上而下”）并促进胆固醇氧化（“自下而上”），有效耗竭胆固醇、缓解缺氧、产生活性氧(ROS)，显著抑制肿瘤生长（抑制率达90%），为HCC治疗提供了新策略。

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其病因复杂、进展迅速、死亡率高。肝脏作为最大的代谢器官，其胆固醇代谢异常与HCC的发生发展密切相关。肿瘤细胞通过劫持低密度脂蛋白受体（LDLR）和增强甲羟戊酸（MVA）途径的胆固醇生物合成来积累胆固醇，从而促进自身增殖。同时，胆固醇的积累还会诱导内质网应激、T细胞耗竭，并上调PD-1、CD244等免疫检查点，促进肿瘤转移。因此，破坏肿瘤细胞中的胆固醇稳态已成为一种有前景的治疗策略。

胆固醇氧化酶（Cholesterol Oxidase, COD）是一种有效的催化剂，不仅能降解胆固醇，还能破坏层状伪足和线粒体功能，从而增强Caspase-1介导的细胞凋亡。然而，单纯消耗胆固醇通常会触发肿瘤细胞的代谢重编程，加速胆固醇的合成作为补偿机制。因此，迫切需要一种能同时增强胆固醇消耗并抑制其合成的“组合拳”策略。

声动力疗法（Sonodynamic Therapy, SDT）因其无创性、组织穿透深度大、安全性好等优点而备受关注。它利用低频超声波（通常为1-3 MHz）激活声敏剂，在肿瘤部位产生大量活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）来杀死肿瘤细胞。然而，SDT会迅速加剧肿瘤缺氧（由于氧气消耗和ROS生成），这不仅降低了其自身的治疗效果，还会通过激活HIF-1α诱导对ROS疗法的耐药性。

为了应对这些挑战，研究人员设计了一种创新的仿生纳米颗粒：HM/ZIF-8@COD/IR820。该颗粒的制备涉及几个关键技术：首先，采用经典的合成方法制备了沸石咪唑酯骨架-8（ZIF-8）纳米颗粒，这是一种金属有机框架（MOF），具有pH响应性，在酸性环境中会分解。随后，将胆固醇氧化酶（COD）和一种近红外声敏剂吲哚菁绿（IR820）封装到ZIF-8中。最后，利用挤出法将肿瘤细胞（Hepa1-6）膜和红细胞膜组成的杂交膜（Hybrid Membrane, HM）包被在纳米颗粒表面，赋予其同源靶向能力和长循环特性。研究中使用的Hepa1-6肿瘤细胞系和小鼠模型是实验室常用模型。

研究结果充分验证了该纳米颗粒的有效性：

2.1. HM/ZIF-8@COD/IR820纳米颗粒的制备与表征

透射电镜（TEM）显示ZIF-8呈球形，直径约111.16 nm，包膜后增至120.16 nm。动态光散射（DLS）显示其水合粒径约为295 nm。颗粒在酸性条件下分解，在中性条件下稳定，实现了靶向药物释放。UV-vis光谱证实了IR820的成功负载，能量色散X射线光谱（EDS）显示了Zn、Na、P元素的存在，证明了COD和IR820的掺入。Western blot和SDS-PAGE证实了杂交膜（包含肿瘤膜蛋白GPC3和红细胞膜蛋白CD47）的成功包被。纳米颗粒在水和10%胎牛血清（FBS）中72小时内表现出良好的稳定性、血液相容性（溶血率<5%）和生物相容性（对正常肝细胞AML12毒性低）。药代动力学显示，包被杂交膜后，纳米颗粒的血浆半衰期从1.749小时延长至3.953小时。

2.2. 酶活性、ROS产生和肿瘤细胞杀伤能力的验证

COD和红细胞膜上过氧化氢酶（Catalase）的活性至关重要。实验表明，HM/ZIF-8@COD/IR820能有效催化胆固醇氧化（消耗胆固醇并产生H₂O₂），且其催化活性和pH稳定性优于游离COD。红细胞膜上的天然过氧化氢酶能快速催化H₂O₂产生O₂，缓解缺氧。使用活性氧指示剂探针DPBF证实，在超声刺激下，声敏剂IR820能产生单线态氧，且产率具有时间和功率依赖性。细胞摄取实验显示，包被了Hepa1-6细胞膜的纳米颗粒（HM组）比只包被红细胞膜的颗粒（RBCM组）更易被Hepa1-6细胞摄取，表现出优异的同源靶向性。在酸性环境和超声刺激下，Zn²⁺和COD的释放加速。用DCFH-DA探针检测发现，HM/ZIF-8@COD/IR820+US处理组的细胞ROS水平最高。活/死细胞染色（Calcein-AM/PI）和Western blot分析表明，该处理能导致超过90%的Hepa1-6细胞死亡，并上调促凋亡蛋白Bax、下调抗凋亡蛋白Bcl-2。

2.3. 细胞内胆固醇水平的降低和细胞迁移的抑制

机制研究表明，纳米颗粒被细胞内化后，在酸性环境和超声作用下降解，释放Zn²⁺和COD。Zn²⁺积累会抑制ATP和NADP⁺的产生（通过ICP-OES和试剂盒检测证实），从而“自上而下”地抑制胆固醇合成。同时，COD“自下而上”地氧化剩余的胆固醇。Filipin染色直观地显示，经HM/ZIF-8@COD/IR820处理后，细胞内的胆固醇水平呈浓度依赖性显著降低。划痕实验表明，该纳米颗粒还能有效抑制Hepa1-6细胞的迁移能力。

2.4. 体内荧光成像

近红外荧光成像显示，游离IR820迅速被代谢，8小时后信号几乎消失。ZIF-8@COD/IR820颗粒在肿瘤部位聚集，信号在8小时达到峰值，但24小时内被快速清除。而HM/ZIF-8@COD/IR820颗粒凭借其同源靶向性，在肿瘤部位的荧光信号在12小时达到最强，并能滞留长达72小时。在注射后12小时取出器官进行离体成像，肿瘤组织的信号最强，进一步证明了其优异的肿瘤靶向性。

2.5. 肿瘤治疗效果评估

体内治疗实验将荷瘤小鼠分为五组： saline（对照组）、HM/ZIF-8、HM/ZIF-8@COD、HM/ZIF-8@IR820+US、HM/ZIF-8@COD/IR820+US。结果显示，HM/ZIF-8@COD/IR820+US联合治疗组的效果最为显著，肿瘤生长被极大抑制，肿瘤重量最轻，抑制率高达90%，甚至有两只小鼠的肿瘤完全消退。小鼠体重和脏器系数无显著变化，血液生化指标（ALT、AST）正常，主要器官的H&E染色未发现明显病理损伤，表明纳米颗粒具有良好的生物安全性和耐受性。肿瘤组织的H&E染色显示该治疗组出现了明显的空洞和破坏。

2.6. 肝细胞癌中的代谢改变

非靶向代谢组学分析揭示了治疗的深层机制。与对照组相比，治疗组有52种代谢物显著上调，60种代谢物下调。KEGG通路富集分析发现，代谢变化涉及萜类骨架 biosynthesis、氮代谢、初级胆汁酸 biosynthesis、牛磺酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、糖酵解以及磷酸戊糖途径等多个通路。代谢网络分析显示，脂酸代谢、亚油酸代谢和磷酸戊糖途径下调，而不饱和脂肪酸生物合成上调。这些变化共同表明，治疗策略成功干扰了肿瘤的能量供应并促进了胆固醇代谢。

综上所述，本研究成功构建了一种多功能仿生纳米颗粒HM/ZIF-8@COD/IR820。它通过“自上而下”（Zn²⁺抑制合成）和“自下而上”（COD促进氧化）的双重策略协同耗竭肿瘤细胞胆固醇，同时利用其声动力特性（IR820产ROS）和缓解缺氧能力（红细胞膜产O₂），实现了对肝细胞癌的高效协同治疗。该研究不仅为克服SDT的缺氧限制和肿瘤胆固醇代谢重编程提供了创新性的解决方案，而且这种基于生物相容性材料的纳米平台展现出巨大的临床转化潜力，为肝癌治疗提供了新思路和新策略。论文发表在《Materials Today Bio》期刊上。