程序性调控小胶质细胞/巨噬细胞极化的双药时序递送水凝胶促进脊髓损伤功能恢复

本研究针对脊髓损伤(SCI)后M1/M2极化过程的动态复杂性，开发了一种基于透明质酸(HA)的双药时序递送水凝胶(DSDH)系统。通过岩藻多糖纳米粒负载米诺环素(MH)实现早期M1极化抑制，利用生物素-链霉亲和素系统控释白细胞介素4(IL-4)促进后期M2极化。实验证明DSDH能程序性调控炎症微环境，显著减少瘢痕形成并促进神经元再生，有效改善运动功能和膀胱功能障碍，为SCI免疫治疗提供了新型时序控释策略。

脊髓损伤是一种毁灭性的神经系统创伤，会导致损伤平面以下感觉和运动功能严重障碍，严重影响患者生活质量。在脊髓损伤的复杂病理过程中，炎症反应扮演着关键角色，其中小胶质细胞（中枢神经系统常驻免疫细胞）和巨噬细胞（从血管内皮浸润而来）的极化状态动态变化尤为关键。这些细胞在损伤区域可极化为"经典激活"的M1表型，释放促炎细胞因子加重损伤并促进瘢痕形成；也可向"替代激活"的M2表型转化，分泌抗炎因子和神经营养因子支持脊髓功能重塑。

然而，脊髓损伤后M1和M2极化响应发生在不同时间点——损伤后第一周M1表型占主导，而M2表型通常在一周后才出现且数量较少。这种时空动态变化给治疗带来了巨大挑战：米诺环素(MH)能有效抑制M1极化但需在早期急性炎症阶段起作用，而白细胞介素4(IL-4)能促进M2极化但应在后期非急性阶段发挥作用。传统的单药递送或非时序双药递送策略无法满足这种动态需求，迫切需要开发能够程序性调控药物释放时序的新型递送系统。

针对这一科学问题，湖南大学生物学院的研究团队在《Materials Today Bio》上发表了一项创新性研究，开发了一种双药时序递送水凝胶(DSDH)系统，通过时空控释策略程序性调控小胶质细胞/巨噬细胞极化，促进脊髓损伤修复。该研究综合运用了纳米粒制备技术、生物素-链霉亲和素亲和系统、水凝胶构建技术和体内外功能评价方法，采用SD大鼠完全性脊髓挫伤模型验证治疗效果。

研究人员首先构建了MH@Fuc NPs纳米递送系统。通过静电相互作用将带正电的MH与带负电的岩藻多糖(Fuc)自组装形成纳米粒，最佳质量比1:15条件下获得的纳米粒流体力学直径为121.3±0.1 nm，包封率达95.76%，负载量约60%。傅里叶变换红外光谱证实MH成功封装入纳米粒中。随后将MH@Fuc NPs加载到基于硫醇-马来酰亚胺点击化学的透明质酸水凝胶中，形成MH@Fuc HAG。扫描电镜显示水凝胶具有高度互联的多孔微结构，适合药物控释和物质交换。

体外释放研究表明，直接加载MH的水凝胶(MH HAG)在24小时内即释放大部分药物，而MH@Fuc HAG实现了持续7天的释放曲线——24小时释放约41%，7天累积释放达85%。在LPS诱导的BV-2细胞炎症模型中，MH@Fuc HAG处理组显著降低了诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达，证实其抑制M1极化的能力。

对于蛋白药物递送平台，研究团队创新性地采用了生物素-链霉亲和素系统。先将生物素-NHS嫁接至蛋白氨基上形成Protein-Biotin，同时通过迈克尔加成反应将Biotin-PEG-Mal嫁接至HA-SH分子链得到HA-SH-Biotin。随后通过链霉亲和素(SA)桥接形成HA-SH-Biotin-SA/Protein-Biotin复合物。最终通过与HA-Mal的迈克尔加成反应形成蛋白负载水凝胶。

使用牛血清白蛋白(BSA)和溶菌酶(Lys)两种模型蛋白验证释放行为，发现非生物素化蛋白在1天内释放62.10%(BSA)和82.64%(Lys)，而生物素-链霉亲和素系统显著减缓了释放速率。在最佳摩尔比(Biotin-PEG-Mal:SA:Biotin-NHS=2:2:1)条件下，IL-4-Biotin HAG实现了长达30天的持续释放：1天释放25.69%，7天释放45.29%，30天释放69.68%。细胞实验证实IL-4-Biotin HAG能有效促进BV-2细胞向M2表型极化，显著增加CD206和精氨酸酶1(Arg-1)表达。

基于以上平台，研究团队构建了双药时序递送水凝胶(DSDH)，将MH@Fuc NPs和IL-4-Biotin复合物共同整合到水凝胶网络中。作为对照，制备了双药非时序递送水凝胶(non-DSDH)，直接封装MH和非生物素化IL-4。流变学表征显示DSDH的储能模量(G′)与MH@Fuc HAG相当，表明IL-4和生物素-链霉亲和素系统的引入对水凝胶流变性能影响极小。

释放曲线证实了DSDH的时序递送能力：MH在7天内持续释放(24小时42.73%，7天77.73%)，而IL-4释放更加缓慢持久(24小时20.19%，7天38.76%，30天64.41%)。相反，non-DSDH中两种药物都呈现快速突释现象。细胞相容性实验显示DSDH提取物处理72小时后PC-12细胞存活率达84.7%，而non-DSDH组仅51.0%，证实时序控释能显著降低药物毒性。

在脊髓损伤大鼠模型中，DSDH展现了卓越的程序性免疫调控能力。Western blot和免疫荧光结果显示，治疗后7天，DSDH处理组iNOS表达显著降低而CD206表达增加；28天后，DSDH组CD206表达显著高于non-DSDH和未处理组，而促炎iNOS表达在所有组中都几乎检测不到。这些结果表明DSDH能早期抑制M1极化，后期促进M2极化，完美匹配脊髓损伤后免疫细胞极化的时空动力学特征。磷酸化STAT6(p-STAT6)免疫荧光染色进一步证实DSDH释放的IL-4保持了生物活性并能有效激活经典信号通路。

功能恢复评估结果令人鼓舞。DSDH治疗组大鼠在28天时BBB评分达到6.2分，表现为后肢足底放置能力，显著优于未处理组(2.5分)和non-DSDH组(2.7分)。足迹分析显示DSDH组步长显著增加而步宽减小，表明前后肢协调性改善。运动诱发电位(MEP)测试显示DSDH组潜伏期缩短、振幅增加，表明电生理传导功能恢复。

特别值得注意的是，DSDH对膀胱功能障碍的改善效果显著。28天后，未处理组和non-DSDH组膀胱出现明显拉伸、变薄、透明度增加和充血，而DSDH治疗显著缓解了这些异常。组织学分析显示DSDH组膀胱壁细胞密度较高，厚度(918 μm)显著大于未处理组(453 μm)和non-DSDH组(598 μm)，更接近假手术组(1479 μm)。

组织学分析还显示DSDH治疗显著减少了损伤腔比例(45.77%)，低于未处理组(59.73%)和non-DSDH组(59.49%)。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达分析表明DSDH能抑制胶质瘢痕形成。同时，神经元标志物Tuj-1(β-III-tubulin)阳性神经元在DSDH组显著增加，神经丝蛋白(NFs)和突触前标志物synapsin I免疫染色显示DSDH促进了神经纤维再生和突触重建。重要器官的组织学分析未发现明显病理异常，证实DSDH具有良好的生物相容性。

研究结论部分强调，这项研究开发的DSDH系统通过时序控释MH和IL-4，成功解决了脊髓损伤后微环境动态变化的治疗难题。该系统能在早期急性炎症阶段抑制M1极化，在后期修复阶段促进M2极化，实现了程序性免疫调控。与非时序递送系统相比，DSDH显著改善了运动功能恢复，减轻了膀胱功能障碍，减少了损伤腔形成，促进了神经元再生和突触重建。这种双药时序递送策略不仅为脊髓损伤治疗提供了新思路，也为其他神经炎症性疾病（如阿尔茨海默病、脑卒中）的治疗提供了可借鉴的策略。

该研究的创新性在于巧妙整合了纳米技术、亲和系统和水凝胶递送平台，首次实现了针对脊髓损伤免疫微环境动态特征的时序药理学调控。未来研究可进一步优化释放动力学，探索其他药物组合，并深入探讨DSDH治疗对脊髓损伤长期恢复的影响。这种程序性递送策略在神经退行性疾病治疗领域具有广阔的应用前景。