4D打印水凝胶搭载piRNA拮抗剂精准调控干细胞微环境促进糖尿病皮肤创面愈合

本刊推荐：针对糖尿病创面干细胞活性受损和微环境失调难题，研究人员开发了搭载piRNA-hsa-32182 antagomir的4D打印壳聚糖温敏水凝胶(4D-CTH)。该研究通过空间转录组学发现piRNA-hsa-32182高表达抑制ADMSCs迁移分化，利用4D生物打印技术构建具有均质孔隙结构的干细胞载体，联合基因调控显著促进胶原沉积、血管新生和免疫微环境重塑，为糖尿病难愈性创面治疗提供新范式。

糖尿病创面愈合面临严峻挑战，不仅存在血管神经损伤，更伴随着干细胞功能受损的困境。传统组织工程策略虽能提供外源性干细胞，却难以逆转高糖环境下干细胞增殖分化的困境。近年来研究发现，Piwi-interacting RNAs（piRNAs）在糖尿病并发症中扮演重要角色，但其在糖尿病足溃疡（DFU）中的具体机制尚不明确。与此同时，三维生物打印技术虽能构建干细胞载体，但传统方法制备的水凝胶存在孔径分布不均、机械支撑不足等问题，无法为干细胞提供理想的生存微环境。

在这项发表于《Materials Today Bio》的研究中，青岛大学研究团队通过创新性地结合4D生物打印技术和基因调控策略，开发了一种能够精准调控干细胞存活微环境的智能治疗系统。研究人员首先通过高通量测序技术发现piRNA-hsa-32182在糖尿病创面中显著高表达，并证实其能够抑制脂肪源性间充质干细胞（ADMSCs）的迁移和分化。基于这一发现，团队构建了壳聚糖基温敏水凝胶（CTH）并通过4D生物打印技术制成具有均匀多孔结构的4D-CTH载体，联合piRNA-hsa-32182拮抗剂，实现了对干细胞空间环境和分化潜能的双重调控。

研究采用的主要技术方法包括：从糖尿病足溃疡患者和双眼皮手术患者获取临床样本进行piRNA测序筛选；使用4D生物打印机（Bio-Architect? SR）制备温敏性水凝胶支架；通过流式细胞术鉴定ADMSCs表面标志物（CD90、CD44、CD45、CD11b）；建立STZ诱导的糖尿病小鼠模型进行体内疗效评价；采用空间转录组学（10x Visium平台）分析免疫微环境变化。

研究结果方面：

通过高通量测序筛选发现piRNA-hsa-32182在糖尿病创面中显著高表达，并证实其表达水平与葡萄糖浓度呈正相关（10-40 mM）。体外实验表明，过表达piRNA-hsa-32182可抑制HaCaT细胞和ADMSCs的迁移能力，而敲低其表达则促进细胞迁移。

成功提取并鉴定了ADMSCs，流式细胞术显示CD90和CD44阳性率超过95%，CD45和CD11b阴性，且细胞具备成脂分化（油红O染色阳性）和成骨分化（茜素红染色阳性）能力。研究发现高表达piRNA-hsa-32182会抑制ADMSCs的迁移和分化潜能。

开发的4D-CTH水凝胶具有温度响应特性，在4°C时呈液态，37°C时转变为凝胶态。扫描电镜显示4D-CTH具有规整的多孔结构（孔径分布均匀），流变学测试表明其粘弹性特征更接近天然脂肪组织，能为干细胞提供更适宜的微环境。

细胞相容性实验证实4D-CTH能显著提高ADMSCs的负载率和存活率，Calcein AM/PI染色显示培养72小时后细胞存活率超过90%。相比未打印的CTH水凝胶，4D-CTH组细胞表现出更强的迁移能力和分化潜能。

动物实验显示，4D-CTH + ADMSCs + piRNA antagomir组在治疗14天后创面愈合率最佳，伤口面积仅为初始面积的10%，显著优于其他各组。组织学分析表明该治疗组表皮增厚明显，胶原沉积密集且排列有序，Masson染色和天狼星红染色显示I型和III型胶原表达均显著增加。

免疫组化和免疫荧光结果显示，治疗组Ki67阳性细胞数显著增加，CD31阳性血管密度提高，α-SMA表达上调，表明细胞增殖、血管新生和细胞迁移能力均得到改善。

空间转录组学分析发现，治疗组创面中T细胞数量显著增加，特别是高表达Ptpn3基因的T1细胞亚群。GO和KEGG富集分析表明这些细胞与Wnt信号通路显著相关，GSEA分析进一步验证了Wnt通路激活。体外实验使用Wnt通路抑制剂IWR-1处理证实抑制该通路会降低HaCaT细胞迁移能力。

研究结论表明，4D打印水凝胶联合piRNA拮抗剂治疗策略通过多机制协同促进糖尿病创面愈合：一方面，4D-CTH提供高度有序的微环境，改善干细胞负载和存活；另一方面，piRNA-hsa-32182拮抗剂通过调控葡萄糖代谢促进干细胞迁移和分化。更重要的是，该治疗策略还能激活Wnt信号通路，调节免疫微环境，促进胶原沉积和血管新生。该研究不仅为糖尿病创面治疗提供了新的技术策略，也展示了4D生物打印技术与基因调控相结合在再生医学领域的广阔应用前景。

讨论部分强调，该研究的创新点在于首次发现piRNA-hsa-32182在糖尿病创面中的关键调控作用，并成功将4D打印技术与基因治疗相结合，实现了对干细胞微环境的精准调控。空间转录组学的应用为理解创面愈合的免疫微环境变化提供了新的视角，Wnt信号通路的发现为后续机制研究提供了新方向。这种多技术融合的治疗策略为复杂组织再生提供了新思路，具有重要的临床转化价值。