L-半胱氨酸通过破坏细胞膜完整性与细胞壁结构抑制Alternaria alternata离体及在体生长的机制研究

本研究发现L-半胱氨酸（Cys）可通过破坏细胞膜完整性（增加核酸/可溶性糖/蛋白质泄漏及MDA含量）和细胞壁结构（下调几丁质、β-1,3-葡聚糖、麦角固醇、磷脂酰胆碱(PC)和DHN-黑色素合成相关基因转录），显著抑制Alternaria alternata菌丝生长、孢子萌发及梨果实黑斑病，为采后病害防控提供新策略。

　　

Highlight

真菌分离株、果实与化学品

Alternaria alternata是渤海大学采后生物学实验室保存的菌株（辽宁，中国）。使用前一日，将菌株接种于新鲜马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板，25°C培养。成熟绿期的‘早酥’梨果实（果肉硬度33±0.82牛顿，可溶性固形物含量11±0.27%）采自锦州果园。选取大小均匀、无机械损伤的果实，用2% NaClO溶液表面消毒2分钟，蒸馏水冲洗三次，自然风干后备用。L-半胱氨酸（Cys）购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州）。

菌丝生长与孢子萌发

Cys以浓度依赖方式显著抑制菌落扩展（图1A）。2.0 g L^-1与3.0 g L^-1 Cys的抑制效果无显著差异。接种6天后对照组菌落直径达7.22 cm时，2.0 g L^-1浓度下的菌丝生长抑制率为60%。值得注意的是，处理的A. alternata菌丝在第2天呈现浅棕粉色，随时间加深至深棕色。Cys对孢子萌发和芽管伸长也有显著抑制（图1B）。对照组孢子萌发率达92.33%，而1.0 g L^-1 Cys处理组仅为16.67%。芽管长度在1.0 g L^-1 Cys处理下较对照组缩短73.97%。通过概率回归分析得出，抑制菌丝生长和孢子萌发的半最大效应浓度（EC₅₀）均为1.0 g L^-1。

细胞膜完整性相关指标

经1.0 g L^-1 Cys处理后，A. alternata菌丝的相对电导率显著降低（图2A）。同时，处理组核酸（图2B）、可溶性糖（图2C）、可溶性蛋白（图2D）的泄漏量以及丙二醛（MDA）含量（图2E）均显著高于对照组。

细胞壁完整性相关基因表达

Cys处理显著下调了多数细胞壁合成相关基因的转录水平（图3）。包括β-1,3-葡聚糖代谢相关基因（AaHxk、AaPgm、AaUgp、AaRHO1、AaGS）、几丁质合成基因（AaPagm、AaUap、AaCHS2/3/4/5/6）、麦角固醇合成基因（AaERG1/3/6/9/11/26）、磷脂酰胆碱（PC）合成基因（AaPsd、AaPem1/2）、黑色素合成基因（AaCct、AaCki、AaPKS、Aa4HNR、Aa3HNR、AaSCD、AaLac）。相反，它上调了Aaβ-1,3-glu的转录水平。

Discussion

Cys被公认为安全氨基酸，是所有还原性含硫生物分子（如胱氨酸、谷胱甘肽、蛋氨酸等）生物合成的主要前体。本研究证明Cys以浓度依赖方式显著抑制A. alternata菌丝生长和孢子萌发，证实其抗真菌潜力。前人研究表明Cys能有效控制多种采后病害，如李褐腐病（通过激活磷酸戊糖途径和抗坏血酸-谷胱甘肽循环中的酶活性和抗氧化剂水平）、无花果霉菌毒素污染（降低交链孢酚甲基醚和细交链孢菌酮酸含量）、Eutypa lata菌丝结构破坏（影响细胞器导致死亡）。本研究首次全面揭示Cys通过破坏细胞膜和细胞壁完整性抑制A. alternata的分子机制，为采后病害防控提供新见解。

Conclusions

Cys处理表现出强效抗真菌活性，有效抑制A. alternata菌丝生长、孢子萌发及梨果实感染。Cys处理增加细胞内含物泄漏、MDA含量，并加速相对电导率下降。此外，它下调麦角固醇和PC合成关键基因的转录水平，从而影响细胞膜通透性和完整性。同时，它破坏细胞壁结构，抑制几丁质、β-1,3-葡聚糖和黑色素生物合成相关基因表达。这些发现为Cys作为控制采后黑斑病的替代措施提供理论依据。