采用能量色散X射线荧光光谱法（EDXRF）并结合化学计量学方法，对无刺蜜蜂产生的蜂胶（geopropolis）和普通蜂胶（propolis）中的矿物进行分类和成分估算

《Microchemical Journal》：Use of energy dispersive X-ray fluorescence spectrometry (EDXRF) with a chemometric approach to classify and estimate minerals in geopropolis and propolis from stingless bees

本研究采用能散X射线荧光光谱法（EDXRF）结合主成分分析（PCA）和偏最小二乘回归（PLS-DA）等化学计量学方法，分析了四棱蜜蜂（Melipona quadrifasciata）、缘纹蜜蜂（Melipona marginata）和四边形蜂（Tetragonisca angustula）产出的蜂胶及地蜂胶的矿物质组成。检测到铝、硅、磷等15种元素，并建立基于标准物质的定量分析模型，误差不超过20%。统计结果显示蜂种及采食行为影响蜂胶矿物质成分，且EDXRF无需复杂前处理，为环境污染物生物指示剂研究提供绿色分析工具。

　　Bruno Belin Dal Santos, ísis Kaminski Caetano, Vanderlei Aparecido de Lima, Yohandra Reyes Torres, Pedro Pablo González-Borrero
Postgraduate Program in Applied Chemistry–State University of Midwest (Unicentro), 85040-167 Guarapuava, Paraná, Brazil

摘要
无刺蜂属Meliponini族能够分泌一种名为树脂（propolis）的物质，其中Melipona属的蜂种尤为著名，它们在树脂中掺入土壤颗粒，形成了所谓的“地树脂”（geopropolis）。这种地树脂因其含有土壤成分而得名，具有广泛的药理活性，并被巴西的原住民社区广泛用于传统医疗实践中。除了其在民族药理学上的重要性，这些产品还可能作为评估蜂巢周围环境污染物的指标。鉴于目前对无刺蜂产品研究的有限性，本研究旨在利用能量色散X射线荧光（EDXRF）技术检测由Melipona quadrifasciata、Melipona marginata和Tetragonisca angustula三种蜂种分泌的地树脂和树脂中所含的矿物成分。通过EDXRF数据的定性分析，研究人员发现这些样本中包含Al、Si、P、S、K、Ca、Ti、Cr、Mn、Fe、Cu、Zn、Sr和Zr等元素。为实现定量分析，研究团队开发了一种基于土壤标准物质SQC001的校准方法，并使用CRM051作为验证样本。通过这种方法，研究人员确定了Si、K、Ca、Cr、Mn、Fe和Zn的浓度，误差值最高可达20%。此外，通过结合EDXRF的定性和定量数据，研究人员使用逻辑回归（LR）方法对样本进行了分类。同时，基于定性光谱数据的主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）方法也用于区分T. angustula分泌的树脂与Melipona属地树脂之间的差异，以及M. marginata和M. quadrifasciata分泌的地树脂之间的差异，表明蜜蜂的采集行为对这两种产品的矿物组成具有显著影响。此外，PLS-DA模型能够将样本分为更多的类别，包括其他Melipona属的样本。PLS模型的建立采用了参考方法与EDXRF光谱数据相结合的方式。EDXRF技术相较于其他用于测定矿物和质量参数的分析方法，其主要优势在于无需复杂的样品预处理，样品可以直接以原始形式进行分析，只需简单的研磨和压片处理。此外，该方法避免了使用有机溶剂、试剂、加热或腐蚀性酸，使得EDXRF成为一种极具吸引力的绿色分析工具，用于评估复杂样品的特性。

引言
蜜蜂的生物分类遵循一定的顺序：亚目Apocrita，超科Apoidea，科Apidae，亚科Apinae。社会性蜂种主要分布在Apini、Meliponini和Bombini三个族中。在巴西，Meliponini族是最具代表性的，涵盖了Tetragonisca和Melipona两个属，这些蜂种在国家的经济中具有重要的地位。Meliponini族的蜂种通常被称为原生蜂、无刺蜂或Meliponines，它们在不同地区和不同物种中拥有多种别称，如manda?aia、uru?u、jandaíra、jataí、tiúba、mirim、mosquito等。无刺蜂的养殖技术被称为meliponiculture，而养殖场所则称为meliponary，其中主要提取蜂蜜、花粉、树脂和地树脂。无刺蜂产品在巴西原住民社区的传统医学中有着深厚的根基，然而这些产品近年来才逐渐引起更广泛的关注。

树脂是一种具有强烈且独特气味的树脂状物质，同时具有良好的粘附性能。蜜蜂通过从树木、花朵、叶片和花粉中分泌物制造树脂，其成分大约包括50%的树脂、30%的蜡、10%的挥发油、5%的花粉和5%的其他有机物质。目前已有超过800种化学成分被鉴定为树脂的组成，其中黄酮类化合物是一个重要的类别，还包括萜类、酚酸、类固醇、糖类及其他化合物。一些Melipona属的蜂种会在树脂中掺入土壤颗粒，形成地树脂，这种地树脂被用于构建蜂巢的内部和外部结构。地树脂的化学组成与树脂类似，具有多种生物活性，如抗菌、抗炎、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等。这些特性通常归因于其植物化学成分，而这些成分又与地树脂的地理来源、蜂巢周围的植被、气候以及无刺蜂的种类密切相关。地树脂中主要的有机化合物包括脂肪酸、有机酸、糖类、醇类、类固醇、多酚类、三萜类和皂苷类。然而，目前对于无刺蜂地树脂或树脂中的无机成分及其可能对树脂物理化学和营养特性的影响，尚缺乏系统的研究。

一些研究者指出，蜜蜂分泌的树脂中特定无机元素的含量与其采集地有关，并可能作为评估蜂巢及其周围环境污染的生物指标。由于地树脂中包含大量土壤残留，因此有必要研究其成分中是否存在有毒元素。尽管存在这种潜在风险，但目前针对无刺蜂地树脂或树脂中矿物和有毒元素的研究仍然较为有限。为了进一步研究这些产品的特性，一些分析技术已被应用，如气相色谱-质谱联用（GC–MS）、近红外光谱（NIR）、液相色谱-质谱联用（UPLC-MS/MS）以及高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）等。这些技术被用于鉴定树脂和地树脂的植物化学组成。对于矿物成分的分析，通常采用石墨炉原子吸收光谱（GFAAS）、火焰原子吸收光谱（FAAS）、电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP OES）、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）以及能量色散X射线荧光（EDXRF）等方法。此外，多变量图像分析（MIA）和近红外光谱（NIR）等方法也被用于估算巴西原生蜂地树脂和树脂的乙醇提取物的抗氧化能力和黄酮类物质含量。偏最小二乘回归（PLS）方法被用于基于光声光谱技术分析蜜蜂树脂中的黄酮类物质含量，以及基于紫外光谱和图像分析技术测定无刺蜂蜂蜜中的脯氨酸含量。

EDXRF技术已被用于分析土耳其的树脂样本，并结合非参数Kruskal–Wallis检验方法，作为替代单因素方差分析（ANOVA）的统计方法进行评估。然而，利用EDXRF技术研究无刺蜂地树脂和树脂的文献仍然较少。鉴于树脂和地树脂在民族药理学上的重要性以及其日益增长的经济价值，显然需要简单有效的分析方法来研究其组成。EDXRF作为一种快速且非破坏性的分析工具，无需复杂的样品预处理，只需简单的研磨和压片处理即可进行分析。因此，本研究旨在验证EDXRF技术在测定无刺蜂地树脂和树脂矿物组成方面的适用性。

在现代数据分析中，化学计量方法，如主成分分析（PCA）和机器学习算法，是处理复杂数据集的强大工具，尤其在化学、生物学和食品科学等领域。PCA是一种无监督的多变量统计方法，能够减少数据维度同时保留大部分的方差。它通过识别主成分及其原始变量的线性组合，揭示数据集中的主要变异。该方法对于探索数据模式、可视化数据簇以及识别异常值具有重要价值，是理解大规模复杂数据集的基础步骤。相比之下，机器学习算法为预测建模和模式识别提供了稳健的框架。这些算法利用统计和计算技术，构建模型以对未见过的数据进行预测或分类。在化学计量学的背景下，监督学习方法如支持向量机（SVM）、随机森林（RF）和人工神经网络（ANN）被广泛用于分类和回归任务。同时，无监督算法如k均值聚类和层次聚类被用于基于内在相似性对样本进行分组。

此外，化学计量方法，如逻辑回归（LR）、主成分分析（PCA）和偏最小二乘回归（PLS）等，被用于开发分类和预测模型，以全面研究地树脂和土壤的特性。这些方法能够帮助研究人员更有效地分析样本数据，揭示不同样本之间的差异，并为环境监测和产品分类提供依据。

地树脂和树脂样本
所有样本分别装入食品级塑料包装中，放入纸箱内，并存放在冷冻环境中。共有46个样本（补充材料中的表S1），其中27个被选用于开发分类模型（逻辑回归），41个用于PCA、HCA和PLS-DA模型，所有46个样本用于PLS预测模型。这种选择旨在构建一个更加均质的数据集；因此，仅使用在巴西南部帕拉纳州采集的样本。这27个样本的采集地点、采集时间和采集方法均被记录，以确保数据的一致性和可比性。通过这种方式，研究人员能够更准确地分析样本的矿物组成，并将其与不同蜂种的采集行为联系起来。

X射线荧光光谱分析的解释
EDXRF分析确定了地树脂样本中所含的Al、Si、P、S、K、Ca、Ti、Cr、Mn、Fe、Cu、Zn、Sr和Zr等元素（图1、图2和表2）。所有样本中Fe的高浓度与[5]的研究结果一致，他们指出地树脂中Fe的高含量是由于土壤中该元素的自然丰富性所致。光谱中的高Rh值则是因为X射线管产生的散射效应。此外，一些研究者发现，树脂中通常含有大量无机元素，这些元素的种类和含量可能受到采集地的土壤成分和植被的影响。因此，通过EDXRF技术，研究人员能够识别出不同样本中所含的无机元素，并将其与蜂种的采集行为联系起来。

在对地树脂样本的分析中，研究人员发现不同样本中无机元素的含量存在显著差异。这些差异可能反映了不同采集地的土壤成分和植被的多样性。此外，某些无机元素的含量可能受到季节变化、气候条件和采集时间的影响。因此，研究人员通过EDXRF技术对样本进行了分析，并结合其他分析方法，如PCA和HCA，以更全面地了解样本的矿物组成。

结论
本研究通过结合EDXRF技术和多变量分析方法，对无刺蜂地树脂和树脂样本进行了综合分析。研究人员确定了样本中所含的无机元素，包括Al、Si、P、S、K、Ca、Ti、Cr、Mn、Fe、Cu、Zn、Sr和Zr。为实现定量分析，研究团队开发并验证了一种基于土壤标准物质SQC001的EDXRF定量方法，用于测定Si、K、Ca、Cr、Mn、Fe和Zn的浓度，误差值最高可达20%。PLS建模表明，基于EDXRF光谱数据，可以开发出能够区分不同样本的模型。此外，通过逻辑回归（LR）、主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）等方法，研究人员能够对样本进行分类，并揭示不同蜂种采集行为对矿物组成的影响。研究结果表明，EDXRF技术不仅能够有效测定无刺蜂地树脂和树脂的矿物组成，而且是一种快速、非破坏性、环境友好的分析工具，适用于复杂样品的分析。因此，该研究为未来进一步研究无刺蜂产品提供了可靠的技术支持，并为环境监测和产品分类提供了新的思路。