COXFA4L3通过增强线粒体复合体IV功能促进ATP合成并驱动精子运动

本研究针对精子发生过程中能量代谢调控机制不清的问题，通过构建Coxfa4l3基因敲除小鼠模型，揭示了睾丸特异性细胞色素c氧化酶亚基COXFA4L3通过增强复合体IV活性，显著提高精子ATP产量和运动能力的重要机制，为男性不育的病因研究和治疗策略开发提供了新见解。

　　

在生物体的能量代谢体系中，ATP的生产和利用是维持生命活动的核心环节。特别是在哺乳动物的精子发生过程中，每天约产生4×10⁶个精子细胞，需要经历严格的细胞分裂、减数分裂和形态变化，每个环节都需要大量ATP支持。而射出后的精子还要在女性生殖道内长距离游动，保持高运动性更需要持续稳定的ATP供应。精子竞争研究表明，运动能力强的精子具有更高的受精几率，这从进化角度凸显了ATP生产增强对生殖成功的重要意义。

然而，调控精子细胞ATP生产的具体通路至今仍不明确。线粒体电子传递链(ETC)中的复合体IV(COX)作为终端酶，是ETC活性的主要调控点，具有组织和阶段特异性亚型。先前研究发现精子中存在特异的COX亚型，如COX6B2和COX8C，它们通过调控复合体IV来优化精子ATP生产。但令人困惑的是，COX6B2缺失会降低精子运动力和雄性生育力，而COX8C缺失却对生育力没有明显影响，这表明精子发生过程中的ATP生产受到复杂调控网络的支配，而非单一代谢通路。

在这项发表于《Mitochondrion》的研究中，研究人员聚焦于一个睾丸特异性细胞色素c氧化酶亚基——COXFA4L3（也称为C15ORF48、NMES1等）。该蛋白最初被发现是在食管鳞状细胞癌中下调表达，研究团队此前已证实它是ETC复合体IV的第十四个亚基。在雄性生殖细胞中，从COXFA4到COXFA4L3的亚型转换发生在早期精子发生过程中，表明它可能在精子发育过程中调控ATP生产。

为了探究COXFA4L3在精子发生中的具体作用，研究人员通过CRISPR/Cas9技术成功构建了Coxfa4l3基因敲除小鼠模型。他们采用了一系列先进的技术方法进行研究：通过免疫组化分析COXFA4L3的时空表达模式；使用蓝绿原生胶电泳(BN-PAGE)和凝胶内活性测定评估线粒体超复合体结构和功能；通过流式细胞术检测活性氧(ROS)水平和线粒体膜电位(MMP)；采用化学发光法测定ATP含量；利用计算机辅助精子分析(CASA)系统评估精子运动参数；并通过氧消耗率(OCR)测量分析线粒体呼吸功能。所有实验均使用8-10周龄的C57BL/6J小鼠，每组至少包含3-5个生物学重复。

研究结果揭示了COXFA4L3在精子发生中的关键作用：

3.1. Production of Coxfa4l3 knockout mouse

研究人员成功建立了Coxfa4l3基因敲除小鼠系，通过测序分析确认了11个碱基对的缺失，Western blot分析证实KO小鼠睾丸中完全缺乏COXFA4L3蛋白表达，而COXFA4表达水平未受影响。

3.2. Phenotypic Characterization and expression Dynamics of COXFA4L3 in the testis

基因型分布符合孟德尔遗传规律，表明Coxfa4l3缺失不会显著影响生育能力。睾丸形态学分析显示KO与WT小鼠之间无显著组织学差异。免疫组化结果显示，COXFA4主要表达在血睾屏障(BTB)的基底侧，而COXFA4L3表达始于细线期精母细胞，随着细胞向管腔室迁移而逐渐增加，在成熟精子中完成完全的亚型转换。

3.3. COXFA4L3 is Dispensable for mitochondrial supercomplex integrity

BN-PAGE分析显示WT和KO小鼠的SC模式无差异，Western blot分析关键ETC组分(复合体I: NDUFA9，复合体III: UQCRC2，复合体IV: COX4I1)进一步证实COXFA4L3缺失未显著改变SC组成。

3.4. COXFA4L3 deficiency has Minimal impact on mitochondrial function in the testis

流式细胞术分析显示，WT和KO组在ROS水平和MMP上均无统计学显著差异。睾丸中的ATP含量在两组间也无显著差别，表明COXFA4L3缺失对睾丸线粒体功能没有重大影响。

3.5. COXFA4L3 promotes COX function and maximal respiratory capacity

凝胶内活性测定显示，复合体I和II活性在WT和KO小鼠间无显著差异，但复合体IV活性在WT线粒体中略有升高。生化测定进一步证实，WT小鼠的复合体IV活性比KO小鼠高约1.7倍。OCR测量显示，虽然基础呼吸无显著差异，但FCCP处理后的最大呼吸在WT线粒体中显著升高。

3.6. Opposing effects of COXFA4L3 on COX activity

研究发现COXFA4L3在不同细胞类型中具有相反的功能：在睾丸中增强COX活性，而在炎症条件下的A549细胞中却抑制COX活性。这种功能差异可能源于不同细胞类型中亚型转换模式的差异。

3.7. COXFA4L3 Boosts sperm ATP generation and motility

在糖酵解非依赖条件下，WT精子的ATP水平比KO精子高1.5倍。CASA分析显示，WT精子在获能后的运动参数（包括前进运动能力）显著高于KO精子，表明COXFA4L3通过增强COX活性来提高ATP产量，促进精子运动。

研究结论与讨论部分强调，COXFA4L3在精子发生过程中通过选择性增强COX活性来优化线粒体功能。从COXFA4到COXFA4L3的亚型转换发生在BTB之后，与精子发生后期ATP需求增加的时间点相吻合。这表明COXFA4L3是精子线粒体能量代谢的重要调节因子，通过优化ATP生产来支持精子运动和受精能力。

值得注意的是，COXFA4L3在不同细胞环境中表现出相反的功能：在睾丸中增强COX活性，而在炎症细胞中抑制COX活性。这种功能差异可能源于不同细胞类型中亚型转换模式的不同以及ETC亚基组成的差异。

这些发现对理解男性不育症具有重要意义。鉴于线粒体功能在精子运动中的关键作用，COXFA4L3的失调可能导致某些形式的男性不育。虽然从小鼠到人类的推断需要谨慎，但未来研究探索COXFA4L3在人类精子中的作用及其与不育症的潜在关联，可能为开发新的诊断和治疗方法铺平道路。

该研究不仅揭示了睾丸特异性COX亚型在调节精子能量代谢中的新机制，也为理解线粒体在不同组织和生理条件下的功能调控提供了重要见解，为男性生殖健康的临床研究提供了新的理论基础和潜在靶点。