多炎症与感染激活下人类循环中性粒细胞脱颗粒程序的蛋白质组学全景解析

本研究针对中性粒细胞在炎症响应中脱颗粒蛋白的动态释放机制尚不明确的问题，通过多状态蛋白质组学分析，系统描绘了人循环中性粒细胞在LPS、PMA、TNF-α和Poly(I:C)刺激下的时空蛋白表达与分泌谱，揭示了其刺激依赖性与时间分层特性，为理解中性粒细胞功能多样性及炎症治疗策略提供了重要资源。

中性粒细胞是外周血中最丰富的白细胞，在抵抗微生物入侵和 sterile 挑战（非感染性炎症）中扮演关键角色。它们通过释放活性氧（ROS）、脱颗粒和形成中性粒细胞胞外诱捕网（NET）等机制快速应对感染。作为中性粒细胞中最丰富的组分，颗粒蛋白构成了其效应功能的主要介质，并可能协调其功能多样性。然而，这些蛋白的系统性特征，尤其是它们在炎症响应过程中的时间释放动态，仍未得到充分解析。此外，成熟中性粒细胞在面对不同来源的信号时表现出高度的异质性和可塑性，例如在招募到组织后迅速获得组织限制性特性，或在不同的肿瘤微环境中发展出促瘤或抗瘤表型。这些发现强调，系统性解析中性粒细胞蛋白质组不仅需要在单一细胞状态下进行快照研究，还需要在多功能状态下进行整体性剖析。

为了深入探索这一问题，研究人员在《Molecular 》上发表了题为“Proteomic portrait of degranulation program in human circulating neutrophils upon multi-inflammatory and infectious activation”的研究论文。该研究采用基于质谱的定量蛋白质组学技术，旨在剖析在多炎症和感染激活状态下循环中性粒细胞的动态响应。

研究人员开展此项研究主要运用了几个关键技术方法：从健康捐赠者外周血中通过密度梯度离心分离出高纯度（>95% CD45⁺CD66b⁺）的循环中性粒细胞；使用多种刺激剂（LPS、PMA、Poly(I:C)、TNF-α）进行时间梯度（0 min至4 h）的体外激活；利用数据非依赖采集（DIA）模式的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术对细胞蛋白质组和条件培养基分泌组进行高通量定量分析；采用DIA-NN软件进行蛋白质鉴定和定量，并运用MFUZZ算法进行时间序列聚类分析；通过流式细胞术和免疫荧光显微镜对关键蛋白的细胞表面表达和亚细胞定位进行验证；使用广谱金属蛋白酶抑制剂GM6001处理以研究MMP/ADAM介导的膜蛋白水解脱落事件。

研究结果部分，通过“Comprehensive proteomic analysis reveals distinct features of human circulating neutrophils across multiple inflammatory states”发现，不同刺激（TNF-α、LPS、PMA、Poly(I:C)）诱导了维度不同的中性粒细胞蛋白质组重塑，PCA分析显示不同处理组的样本明显分离。形态学观察和CD11b表面表达检测证实了TNF-α、LPS和PMA能有效激活中性粒细胞，而Poly(I:C)的激活效应较弱。

在“Temporal analysis of expression patterns identifies neutrophil signature protein clusters rich in biological information”中，通过时间序列聚类分析揭示了不同的调控模式。上调趋势的簇富集了如“胆固醇稳态”、“抗菌体液应答”、“PI3K-Akt信号通路”等功能；而下调趋势的簇，特别是在TNF-α、LPS和PMA刺激中，多个簇被注释为“中性粒细胞脱颗粒”，表明脱颗粒程序是炎症刺激中一个广泛诱导的 essential 响应。

“Circulating neutrophils have conserved core regulatory mechanisms in response to major inflammatory stimulation”部分筛选出36种在TNF-α、PMA和LPS处理下表达模式一致的蛋白质。其中包括经典促炎介质CXCL8和IL1B的保守上调模式，以及许多经典中性粒细胞颗粒蛋白（如PGLYRP1、MMP9、MMP8和CD16）的保守下调模式，表明脱颗粒过程在激活的中性粒细胞中启动非常迅速。

“Integrated secretome and cellular proteome delineate the neutrophil degranulation process upon inflammation”整合了细胞蛋白质组和分泌组数据，鉴定出468种中性粒细胞释放蛋白，其中226种是先前报道的颗粒蛋白，242种是未分类的释放蛋白（非经典颗粒蛋白）。研究详细描绘了各类颗粒（嗜天青颗粒、特异性颗粒、明胶酶颗粒、分泌囊泡）标志物蛋白的细胞内外动态表达模式，揭示了其刺激依赖性和时间分层的分泌特性。例如，特异性颗粒、明胶酶颗粒和分泌囊泡表现出优先分泌，而嗜天青颗粒标志物蛋白则表现为分泌但细胞池未显著耗竭。

“Neutrophil release diversified granule proteins to cope with different inflammatory conditions”总结了不同炎症条件下颗粒蛋白的胞外释放水平，表明PMA处理诱导了最广泛的蛋白释放，而LPS和TNF-α则显示出刺激特异性的释放方式，如BPI在LPS中诱导释放而MPO在TNF-α中释放更显著。

“The secretion of non-canonical released proteins by the stimulated neutrophils”部分关注了242种非经典释放蛋白，其中许多被预测通过经典或非经典途径分泌。研究重点介绍了TIMP1、TGF-β1以及免疫受体SIRPB1、LILRA2和LILRA5等关键炎症介质的诱导性分泌，扩展了对中性粒细胞免疫调节功能的理解。

“Inflamed neutrophils release their granule membrane proteins into the extracellular compartment through MMP/ADAMs mediated proteolytic shedding”有了一个关键发现：20种颗粒膜蛋白（如CD35、CD18、OLR1、CD93、SIRPB1、CD16、CD177、CD11b）通过MMP/ADAM介导的蛋白水解脱落机制，将其胞外域剪切并释放到细胞外环境。GM6001抑制实验证实了该过程。流式细胞术分析进一步揭示了这些膜蛋白在细胞表面的表达水平受到复杂调控，例如CD11b和OLR1表面水平增加，而CD16保持不变，表明存在补充蛋白水解损失的稳态维持机制。不同刺激下，这些膜蛋白对GM6001的敏感性也不同，提示存在不同的脱落机制。

论文的讨论与结论部分归纳指出，本研究通过时间分辨的蛋白质组学分析，系统描绘了循环中性粒细胞在多种炎症和感染信号下的动态响应和脱颗粒程序。研究不仅验证了先前基于亚细胞分级研究定义的颗粒蛋白，更重要的是在功能释放的层面上提供了其动态分泌图谱，揭示了其刺激依赖性和时间分层的特性。研究发现并验证了颗粒膜蛋白通过MMP/ADAM介导的胞外域水解脱落是其进入胞外环境的一个重要新机制，这为了解可溶性免疫受体和粘附分子的来源提供了新视角。此外，研究还鉴定了一批具有潜在分泌能力的非经典释放蛋白，如TIMP1、TGF-β1和多种免疫受体（LILRA2, LILRA5, SIRPB1），它们可能作为新型炎症介质或疾病生物标志物。这些发现极大地丰富了我们对中性粒细胞功能多样性和可塑性的理解，为开发针对中性粒细胞介导的炎症性疾病的管理策略提供了宝贵的分子图谱和数据资源。