嗜热四膜虫蛋白质基因组学重评估揭示其生命周期调控新机制及广泛翻译后修饰图谱

本研究针对嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)基因注释不完整的问题，通过多阶段蛋白质基因组学分析，整合基因组测序与高分辨率质谱技术，系统验证了24,319个已知基因并新发现383个基因，首次绘制了涵盖7,123个修饰位点的PTMs全景图谱，为理解真核生物发育调控和进化提供了重要分子资源。

嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）作为单细胞真核模式生物，在细胞生物学、进化研究和环境毒理学中具有重要价值。其独特的生命周期包括生长、饥饿和接合三个主要阶段，伴随着复杂的核分化过程——具有转录活性的体细胞大核（MAC）和用于遗传信息传递的生殖系微核（MIC）。自2006年首次基因组测序完成以来，虽然测序技术不断进步（包括2021年完成的端粒到端粒MAC组装），但基因预测的准确性和完整性仍存在显著局限。传统生物信息学方法依赖于算法预测和同源比对，容易遗漏短开放阅读框（sORF），且难以捕捉动态表达基因和条件特异性功能基因。此外，翻译后修饰（PTM）在调控生命周期转换中的重要作用尚未系统揭示。这些不足限制了利用四膜虫开展高水平功能基因组学研究的能力。

为解决上述问题，研究人员开展了一项跨越十个关键生命周期阶段的大规模蛋白质基因组学（proteogenomic）研究，结合高通量基因组测序与高分辨率质谱（MS）技术，对嗜热四膜虫的基因注释进行了系统性重评估。该研究成果已发表在《Molecular & Cellular Proteomics》上。

本研究主要采用了以下关键技术方法：首先，采集了包括营养生长、饥饿诱导、接合生殖及性后代成熟前后等十个状态的细胞样本；其次，利用基于液相色谱－质谱联用（LC-MS/MS）的蛋白质组学技术，采用溶液内和胶内酶切相结合的策略提高肽段覆盖度；第三，通过自研的GAPE软件整合pFind搜索引擎进行开放搜索，无需预先定义修饰参数，从而实现非偏倚的肽段和修饰鉴定；第四，结合RNA测序（RNA-seq）数据进行转录组与蛋白质组关联分析；此外，还使用Western blot和荧光染色技术对关键修饰和细胞结构进行验证。

研究结果主要包括以下几个方面：

蛋白质组数据生成及覆盖度分析

研究人员在十个生命周期状态中共鉴定到421,002条独特肽段，覆盖24,319个蛋白质编码基因（占基因组预测基因的90.9%），平均每个蛋白有17.3条独特肽支持。序列覆盖度达20.26%，其中567个蛋白覆盖度超过90%。功能注释显示这些蛋白广泛参与催化活性、结合、转运以及细胞过程、代谢调控和应激响应等生物学过程。

蛋白质组与转录组比较分析

研究发现在不同生命周期状态下，转录组和蛋白质组表达谱呈现状态特异性特征。C12（新大核形成）和C18（接合后）时期高表达蛋白数量最多，功能富集于翻译后修饰、碳水化合物代谢、染色体动态及DNA修复等过程，与核重编程和发育转换密切相关。

全局翻译后修饰鉴定

研究系统鉴定了30类常见真核生物修饰类型，共发现4,705个修饰蛋白和7,123个修饰位点。其中赖氨酸甲基化（包括单/双甲基化和三甲基化）丰度最高。Western blot验证显示甲基化修饰水平存在状态特异性差异。组蛋白H3和H4上发现多个新颖修饰位点，如H3K122乙酰化和三甲基化、H4K91乙酰化等。此外，微管蛋白（α-tubulin和β-tubulin）上也鉴定到大量PTMs，包括已知的K40乙酰化及 novel S140和T107磷酸化位点。

新基因鉴定

研究共发现383个新基因，其中347个得到转录组数据支持。这些新基因平均长度仅69个氨基酸，可能编码重要的小蛋白。例如，位于染色体1上的NG1和NG2基因编码含DUF3638结构域的蛋白；染色体4上的NG3与 cytoplasmic dynein heavy chain (DYNC1H1) 同源，可能参与细胞质运输和分裂调控。

状态特异性蛋白功能分析

研究揭示了不同生命周期状态下特异性高表达蛋白的功能偏好性：营养生长（G）阶段富集于转录、PTM和核苷酸代谢；饥饿（S3/S15）阶段与氨基酸代谢、抗氧化和脂类分解相关；接合早期（C2）涉及细胞骨架重塑和染色质调控；C12和C18阶段则与DNA拓扑调控、RNA修饰和DNA修复密切相关。

本研究通过蛋白质基因组学重评估显著提升了嗜热四膜虫基因注释的完整性和准确性，为后续功能研究提供了坚实基础。首次大规模PTM图谱的绘制揭示了修饰调控在生命周期转换中的核心作用，尤其是组蛋白和微管蛋白上的新颖修饰位点，为研究真核生物表观遗传和细胞动力学提供了新视角。此外，新基因的发现及状态特异性表达分析为了解四膜虫在适应环境变化和完成有性生殖过程中的分子调控网络提供了宝贵资源。该研究不仅深化了对单细胞真核生物复杂生命过程的理解，也展示了蛋白质基因组学策略在基因组注释和功能发现中的强大能力。