ERG24甾醇C-14还原酶对杂环胺类抗真菌药物的耐药性机制与结构基础研究

本研究针对真菌耐药性日益严峻的全球性问题，通过发现小麦白粉病菌ERG24甾醇C-14还原酶的V295L和D291N突变介导对苯丙基胺类杀菌剂的耐药性，利用酵母CRISPR/Cas9单碱基编辑技术验证突变功能，结合蛋白建模揭示该类抑制剂通过竞争性阻断底物通道而非直接作用于催化位点的全新机制，为开发靶向ERG24的新型抗真菌药物提供了关键理论基础。

随着侵袭性真菌病原体对临床抗真菌药物耐药性的广泛出现，以及农作物病原菌对杀菌剂抗性的快速进化，开发具有新颖作用机制的抗菌剂已成为人类健康和粮食安全的迫切需求。目前医学和农业领域最广泛使用的唑类(azoles)抑制剂主要靶向ERG11/CYP51（羊毛甾醇14α-去甲基化酶），而长期大量使用导致许多病原菌产生耐药性，尤其对单作用位点抑制剂更为严重。更复杂的是，唑类药物在人类医学、兽医、木材防腐和作物保护中的双重使用，导致从不同环境获得的耐药真菌引起难以控制的感染，这不仅发生在众所周知的黑曲霉(Aspergillus fumigatus)，也包括其他重要病原真菌。

尽管需要更多样化作用机制的抗真菌药物，但投资新作用机制抑制剂面临监管挑战。现有抗真菌药物组可能提供有用的先导化合物，特别是那些迄今使用有限、作用机制已知且耐药机制清楚的药物。N-取代杂环胺类抗真菌药物已在农业和医学中使用，如1983年引入的苯丙基胺类化合物fenpropimorph（带叔丁基苯基甲基丙基侧链）是目前农业中使用最广泛的胺类杀菌剂。胺类抗真菌药物抑制ERG24和ERG2两种酶，它们催化甾醇合成中C:C双键的还原或重排，从而抑制真菌细胞分裂。

在这项发表于《npj Antimicrobials and Resistance》的研究中，研究人员通过分析小麦白粉病菌(Blumeria graminis f.sp. tritici)对fenpropimorph的耐药性，发现ERG24甾醇C-14还原酶的突变介导了耐药性产生，并通过酵母模型验证了这些突变的功能效应，结合蛋白结构建模揭示了胺类药物的作用机制和耐药机制。

研究团队运用了几项关键技术：收集2014-2015年来自温室和农田空气孢子的白粉病菌分离株进行表型分析；通过PCR扩增和Sanger测序分析ERG24和ERG2基因序列变异；利用CRISPR/Cas9单碱基编辑技术在酵母中构建同源点突变株；采用AlphaFold2进行蛋白质结构预测和AutoDock Vina进行分子对接模拟；通过微量板培养系统测定酵母生长参数评估抗真菌药物敏感性。

Detection of fenpropimorph-resistant wheat mildew

研究发现2014年温室中小麦白粉病菌对fenpropimorph（商品名Corbel）和azole类prothioconazole（商品名Proline）的控制效果不佳。分离株根据其中位有效剂量(ED₅₀)分为敏感组(FPM-S)和耐药组(FPM-R)，敏感组ED₅₀为9.2-12.2 mL ha^-1，而耐药组为57.6-402 mL ha^-1，敏感性降低14倍。大麦白粉病菌(Blumeria graminis f.sp. hordei)对Corbel更为敏感。

Erg24 and Erg2 sequences

在Blumeria graminis基因组数据中只检测到一个Erg24基因。Bgt分离株96224和Bgh分离株DH14的Erg24序列与GenBank登录号相同。预测的ERG24蛋白有489个氨基酸和10个预测跨膜(TM)片段。所有FPM-R分离株（包括96224）都有938 G>C替换，产生V295L突变（位于TM7）。两个近期Bgh分离株中，W4也有938 G>C突变，而CC148有926 G>A突变，导致BghERG24的TM7发生D291N替换。

Phenotypes of ERG24 mutations in yeast

通过在酵母中构建ScERG24的点突变株（V291L、D287N、双突变D287N/V291L等），发现V291L突变提高了对amorolfine的低ED₅₀值，并消除了对fenpropimorph和fenpropidin的低ED₅₀值，表明它降低或消除了对苯丙基胺类更敏感靶点的响应性。D287N也消除了fenpropidin的低ED₅₀值，但与野生型Val291结合时，对amorolfine和fenpropimorph低ED₅₀的影响小于单独的V291L突变。

Models of ScERG24 structure and ligand docking

通过AlphaFold2对酵母S288C-WT、Bgt JIW11和Bgh DH14的ERG24蛋白进行建模，模型与甲基营养菌Methylotuvimicrobium alcaliphilum中MaSR1酶的晶体结构高度相似。真菌ERG24预测有十个跨膜(TM)片段和由TM6、7和10形成的通道，有两个开口面向通道内的同一口袋。分子对接表明，胺类抗真菌药物可能通过膜面向开口进入反应口袋，而非直接模仿甾醇底物或干扰△¹⁴还原。

Effect of ScERG24 mutations on yeast fitness

胺类耐药性突变改变了酵母的一些生长参数。D287N突变使最终OD₆₀₀降低2.7%，V291L使生长速率参数降低2.7%，V291L-1的拐点提前6.7%。

研究结论表明，ERG24中的点突变（小麦白粉病菌中的V295L和大麦白粉病菌中的D291N）导致对杂环胺类杀菌剂的耐药性，这些突变对有丝分裂适应性影响很小。预测蛋白建模表明，苯丙基胺类可能阻碍甾醇底物进入催化位点，从而作为竞争性抑制剂，但不直接结合催化残基。这些发现为靶向ERG24的新型抗真菌药物的结构导向开发提供了重要见解，可作为广泛使用的ERG11抑制剂的替代方案。

该研究的重要意义在于揭示了胺类抗真菌药物与ERG24相互作用的结构基础，提出了耐药性突变的新机制，并为设计具有更高疗效和特异性的新分子提供了机会。这些新分子可以与真菌相对于植物或动物共有的Synapomorphic残基相互作用，包括含有不变BgtAsp277的TM6-7连接子中的几个位点。如果更有效的苯丙基胺类药物可用于内科医学（目前几乎没有替代方案），这些抗真菌药物可以保留用于医疗用途，从而减少相同作用机制分子在作物保护和木材保存中的双重使用。