TRIM39通过去泛素化RNF168逃逸自噬-铁死亡在三阴性乳腺癌中的机制研究与治疗意义

本研究针对三阴性乳腺癌（TNBC）缺乏有效治疗靶点的临床难题，深入探讨了TRIM39-RNF168轴在调控细胞死亡中的关键作用。研究人员通过分子生物学实验和体内外模型，首次揭示TRIM39通过去泛素化稳定RNF168，从而抑制自噬耦合铁死亡的新机制。研究发现靶向该轴可显著激活铁死亡通路，抑制肿瘤生长，为TNBC治疗提供了新的策略方向和潜在靶点。该成果对改善TNBC患者预后具有重要科学价值和临床转化意义。

　　

三阴性乳腺癌（TNBC）作为乳腺癌中最具侵袭性的亚型，长期以来缺乏有效的靶向治疗方案，患者预后较差，尤其亚洲女性死亡率居高不下。目前临床治疗主要依赖手术、化疗和放疗，但效果常不尽如人意。尽管近年来PARP抑制剂、免疫检查点抑制剂和抗体药物偶联物等取得一定进展，TNBC的治疗仍面临重大挑战。细胞程序性死亡机制的深入研究为癌症治疗提供了新视角，其中铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖性的脂质过氧化驱动的新型细胞死亡方式，与自噬（autophagy）之间存在复杂的交互作用，成为肿瘤治疗的新兴研究方向。

在这项发表于《npj Breast Cancer》的研究中，研究人员聚焦于TRIM39和RNF168这两个蛋白在三阴性乳腺癌中的作用机制。TRIM39是TRIM家族成员，具有独特的双向催化活性，既可能作为E3泛素连接酶，又可能发挥去泛素化酶功能。而RNF168作为具有E3泛素连接酶活性的RING finger蛋白，在DNA损伤修复中已知发挥重要作用，但其在细胞死亡调控中的作用尚未明确。

为了深入探索TNBC的分子机制，研究团队运用了多种关键技术方法：包括临床样本分析（来自复旦大学附属中山医院2022-2024年收集的TNBC患者肿瘤及癌旁组织）、分子互作验证（Co-IP和 ubiquitination assays）、细胞功能实验（细胞活力、迁移、线粒体功能检测）、体内动物模型（BALB/c裸鼠移植瘤实验）以及分子探针成像技术（检测ROS、自噬流等）。这些方法的综合运用为研究结论提供了多层次的证据支持。

TRIM39和RNF168与TNBC进展呈正相关

通过临床TNBC样本分析发现，RNF168在肿瘤组织中的蛋白表达水平显著高于癌旁正常组织，且与患者不良预后相关。有趣的是，虽然RNF168在转录水平表现出较大异质性，但其整体mRNA表达并未显著高于正常个体，提示RNF168可能在TNBC中经历翻译后修饰。进一步筛选发现TRIM39与RNF168密切相关，其在TNBC患者肿瘤样本中特异性过表达，且高表达与不良预后趋势相关。GSE45827数据集分析显示，与RNF168不同，TRIM39转录本在TNBC患者中显著高于正常个体。免疫组化染色直观显示了RNF168和TRIM39在肿瘤细胞中的富集情况，相关性分析进一步阐明RNF168表达与铁死亡显著相关。

TRIM39通过去泛素化正向调控RNF168水平

研究人员选择了多种乳腺癌细胞系进行体外实验，发现TRIM39和RNF168在TNBC细胞中呈现高度异质性，且两者表达呈正相关。在TRIM39表达最高的MDA-MB-157和MDA-MB-231细胞中进行敲低实验，发现TRIM39 knockdown导致RNF168水平降低。当使用蛋白质合成抑制剂后，TRIM39敲低加速了RNF168的降解，表明TRIM39调控RNF168稳定性。通过相互Co-IP实验证实了TRIM39和RNF168之间存在直接相互作用。

研究发现TRIM39发挥去泛素化酶功能而非泛素连接酶活性。使用蛋白酶体抑制剂MG132处理可部分恢复TRIM39敲低引起的RNF168减少，表明该过程与泛素-蛋白酶体降解途径相关。泛素化分析显示TRIM39敲低细胞中RNF168泛素化显著增加。引入催化失活的TRIM39-C44A突变体证实其无法去泛素化Myc标记的RNF168，表明锌结合RING结构域对TRIM39的去泛素化活性至关重要。进一步实验证明TRIM39特异性靶向Lys48连接的泛素化，而非Lys63连接。

TRIM39调节TNBC细胞的铁死亡抗性和细胞活力

生物信息学分析提示RNF168与铁死亡潜在相关，而实验证明TRIM39通过去泛素化正向调控RNF168，因此推断TRIM39与铁死亡存在间接联系。TRIM39敲低导致长链脂肪酰辅酶A连接酶4（ACSL4）活性增加，促进铁死亡；铁蛋白重链1（FTH1）减少，表明铁稳态向游离Fe²⁺转变；谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）水平降低，提示细胞抗氧化能力减弱。

生化标志物检测显示，TRIM39敲低导致谷胱甘肽（GSH）减少，表明抗氧化潜力降低；丙二醛（MDA）水平增加，反映脂质过氧化增强；Fe²⁺水平升高，表明游离铁增加，可能促进Fenton反应并触发铁死亡。C11探针染色显示TRIM39敲低细胞中ROS水平显著高于对照组。

使用不同浓度铁死亡激活剂erastin处理时，TRIM39敲低细胞存活率低于对照细胞，表明TRIM39敲低使肿瘤细胞对铁死亡敏感，而高TRIM39表达赋予肿瘤细胞铁死亡抗性。MitoTracker探针检测显示TRIM39敲低后线粒体红色荧光减少，表明线粒体损失和能量缺陷。集落形成实验显示TRIM39敲低TNBC细胞增殖能力降低，transwell实验显示迁移能力下降。CFDA染色表明TRIM39敲低显著降低细胞活力，PI染色显示PI阳性细胞显著增加。上皮-间质转化（EMT）相关蛋白显示EMT抑制趋势。

在TRIM39水平天然较低的BT549和HCC1937细胞系中，TRIM39过表达显著增加增殖、增强EMT标志蛋白水平、提高迁移能力，同时降低细胞死亡率、提高细胞活力。铁死亡相关蛋白和生化指标指向铁死亡减少，细胞内脂质过氧化水平降低。erastin处理后细胞活力改善，具有功能线粒体的细胞比例增加。这些结果表明TRIM39表达与铁死亡负相关，但与铁死亡抗性和细胞活力正相关。

TRIM39调节肿瘤细胞自噬

最近研究越来越强调自噬与铁死亡之间的联系。为了研究TRIM39是否参与自噬调控，研究人员使用mRFP-GFP-LC3双荧光标记慢病毒作为探针。在中性条件下，mRFP-GFP标记的LC3同时发射红色和绿色荧光，黄色斑点代表自噬体，红色斑点代表自噬体和自噬溶酶体。定量分析显示TRIM39敲低增加了LC3阳性斑点的总数，但mRFP+GFP-斑点（自噬溶酶体）与mRFP+GFP+斑点（自噬体）的比率降低，表明自噬体积累和自噬体-溶酶体融合受损。

电镜观察证实了这些发现，显示TRIM39敲低细胞中自噬体大量增加，自噬溶酶体显著减少。相反，对照细胞显示相当数量的自噬体和自噬溶酶体。这些观察表明TRIM39调节自噬体-溶酶体融合，当TRIM39下调时，自噬溶酶体形成减少，导致自噬体积累。尽管LC3阳性斑点增加，但自噬进程可能受阻。

关键自噬相关蛋白的WB分析与这一假设矛盾。TRIM39敲低导致自噬体形成必需的ATG7增加，而自噬抑制蛋白p62减少，表明自噬流增强。换句话说，TRIM39敲低促进了自噬体形成，且自噬溶酶体降解（回收）速率超过对照细胞。

此外，在TRIM39过表达的BT549和HCC1937细胞系中，观察到LC3阳性细胞减少，自噬溶酶体与自噬体的比率显著增加，表明自噬体形成减少。WB分析显示p62水平增加，LC3B活性降低。相反，在TRIM39敲低和TRIM39过表达细胞系中观察到相反的自噬相关变化，表明TRIM39在TNBC细胞中对自噬发挥明显的负调控作用。

TRIM39介导的铁死亡和自噬呈现相互促进

研究已证实TRIM39独立负调控铁死亡和自噬，因此研究人员假设由TRIM39敲低激活的铁死亡和自噬可能相互关联。在过表达TRIM39的BT549和MDA-MB-231细胞系中，引入铁死亡诱导剂erastin后，WB分析显示自噬标志物LC3增加，负标志物p62减少。自噬相关蛋白ATG5、ATG7和Beclin-1在erastin暴露后显著升高。荧光成像证明erastin在MDA-MB-231细胞中诱导自噬体显著增加，而TRIM39过表达减弱了这种增加，表明TRIM39抑制erastin诱导的自噬体形成。

比较载体对照和erastin处理组，发现erastin诱导的铁死亡促进自噬，而这种铁死亡依赖性自噬可被TRIM39过表达抑制。合理解释是铁死亡损伤线粒体等细胞器，触发自噬作为反馈机制清除受损组件。TRIM39过表达减少铁死亡，从而降低对自噬的需求，通过下游信号级联导致自噬活性降低。

研究人员进一步用自噬抑制剂氯喹（CQ）处理MDA-MB-231细胞来研究TRIM39对自噬的负调控，其中自噬已被TRIM39敲低增强。WB分析显示CQ处理后p62水平显著增加，表明自噬抑制。LC3表达随TRIM39敲低状态变化显著，提示TRIM39通过不同于CQ的机制调节自噬。铁死亡相关蛋白分析显示FTH1和GPX4在TRIM39敲低后减少，但在CQ处理后增加，表明它们对自噬降解敏感。

铁死亡生化标志物显示，代表抗氧化能力的GSH水平在TRIM39敲低后显著降低，而CQ逆转了这种效应。MDA水平随TRIM39敲低增加，但随CQ处理减少；Fe²⁺水平被TRIM39敲低升高，且不受CQ影响。这些结果表明TRIM39通过自噬调节GPX4来调节氧化稳态，通过非ACSL4途径控制MDA水平，Fe²⁺通过CQ非依赖性机制调节。值得注意的是，LC3随TRIM39敲低波动更大，而CQ主要影响p62，提示TRIM39影响自噬体形成而非自噬体降解。

除药理学方法外，研究人员还通过敲低自噬体形成和LC3脂化必需的ATG5来抑制自噬。ATG5敲低降低LC3水平，且在没有同时TRIM39敲低的情况下显著增加p62水平，表明自噬流减少。即使没有铁死亡诱导剂，铁死亡相关蛋白和生化标志物的波动也与TRIM39敲低诱导的自噬变化相关。与对照相比，TRIM39敲低导致自噬和铁死亡同时增加。然而，ATG5敲低显著降低ACSL4水平，同时增加FTH1和GPX4，伴随GSH增加和MDA、Fe²⁺减少，表明铁死亡减少。这些发现表明TRIM39和ATG5对自噬产生相反影响，且这种拮抗关系延伸到铁死亡调控。

RNF168敲低抑制TRIM39过表达诱导的肿瘤细胞增殖表型

TRIM39已知通过去泛素化正向调控RNF168，同时通过铁死亡负调控TNBC肿瘤细胞存活。因此，研究人员假设作为TRIM39下游靶点的RNF168也可能在调节肿瘤细胞铁死亡中发挥作用，从而影响肿瘤表型。

在MDA-MB-157和MDA-MB-231细胞中过表达RNF168后，观察到与自噬负相关的自噬相关蛋白p62表达减少。同时，细胞迁移能力随RNF168过表达显著增强。重要的是，p62不仅是自噬的负标志物，也是自噬过程本身的负调节因子。为了进一步研究，研究人员在RNF168过表达细胞中敲低p62以诱导自噬。观察到p62敲低诱导的自噬显著抑制TNBC细胞的增殖和迁移，且RNF168过表达诱导的增殖和迁移增强不足以抵消这种抑制。

为了进一步探索TRIM39和RNF168之间的关系，研究人员在TRIM39过表达细胞中敲低RNF168。在TNBC肿瘤细胞的集落形成和transwell迁移实验中，RNF168敲低不仅抵消了TRIM39过表达诱导的增殖和迁移表型，而且显著降低了与无TRIM39过表达的对照组相比的增殖和迁移。这一结果可能归因于MDA-MB-231细胞中TRIM39的高表达。尽管RNF168敲低后有无TRIM39过表达的组间差异（第3组对第4组）仍然具有统计学意义，但差异幅度小于无RNF168敲低时观察到的差异（第1组对第2组）。这些发现表明，与TRIM39相比，RNF168对肿瘤增殖和迁移表现出更强的负调控作用，可能由于其位于TRIM39下游，能够更直接地激活下游信号级联。

在铁死亡相关实验中，RNF168敲低导致ACSL4表达显著增加，而FTH1和GPX4水平显著降低。此外，GSH水平显著降低，而MDA和Fe²⁺水平显著增加，表明铁死亡增强。

为了在体内进一步验证这些发现，研究人员将处理过的细胞皮下移植到小鼠体内建立肿瘤生长模型。肿瘤体积生长曲线显示，仅RNF168敲低的细胞系生长最慢。RNF168敲低抑制了TRIM39过表达诱导的肿瘤细胞增殖加速，导致生长速率与对照组相似。最终肿瘤重量测量证实了肿瘤体积生长数据。肿瘤切片组织病理学染色显示，肿瘤内空腔形成程度与体外实验中观察到的铁死亡程度相关。这些结果表明，在高TRIM39表达的TNBC肿瘤组织中，靶向抑制RNF168可产生显著的抗癌效果。

TRIM39通过增强TNBC细胞的铁死亡抗性促进肿瘤发生

先前实验证明TRIM39敲低激活铁死亡，降低肿瘤细胞活力，而TRIM39过表达促进肿瘤细胞增殖和侵袭。基于这些发现，研究人员进行了体内反向验证，测试TRIM39过表达是否能在铁死亡应激下维持其致癌作用。通过TRIM39过表达诱导致瘤表型，然后诱导铁死亡，以评估TRIM39是否仍能在铁死亡压力下促进肿瘤生长。

集落形成实验显示，erastin处理显著抑制了TRIM39过表达的增殖效应。同样，在transwell迁移实验中，erastin显著抑制了BT549细胞的迁移。然而，即使在erastin处理下，有无TRIM39过表达的细胞在增殖和迁移方面仍存在轻微但统计学显著的差异，表明TRIM39对erastin诱导的铁死亡发挥拮抗作用。

铁死亡相关蛋白水平和生化标志物也观察到类似趋势，其中铁死亡促进因子与肿瘤增殖和侵袭负相关，而铁死亡抑制因子与这些致瘤特性正相关。这些结果表明，TRIM39-RNF168介导的铁死亡抗性与TNBC细胞的肿瘤增殖和侵袭负相关。

体内模型证实了这些发现。注射肿瘤细胞并经腹腔注射erastin处理的小鼠显示显著的肿瘤生长抑制。然而，TRIM39过表达部分抵消了erastin的抑制效应，导致肿瘤生长曲线与对照组相似。组织病理学分析进一步支持这些观察结果。对照组显示肿瘤组织空腔稀疏，而过表达TRIM39的肿瘤致密且无空腔。两个erastin处理组均显示明显的空腔形成，尽管TRIM39过表达组的空腔程度略有减少。这些发现证实，增强TNBC肿瘤细胞对铁死亡的抗性是TRIM39发挥其致癌作用的关键机制。

研究结论与意义

本研究首次揭示了TRIM39-RNF168泛素化轴在TNBC模型中靶向自噬依赖性铁死亡的作用机制。TRIM39作为去泛素化酶，通过与其相互作用特异性展现出去泛素化活性。调控TRIM39-RNF168轴（通过敲低TRIM39或RNF168）可激活TNBC细胞中自噬耦合的铁死亡。激活的自噬-铁死亡通路有效抑制体内TNBC进展，提供了一个有前景的潜在治疗方法。

研究表明，TRIM39通过去泛素化稳定RNF168，创造了一种基因组控制的假象，使肿瘤细胞能够逃避遗传监视的自毁机制。在TNBC中，高TRIM39表达稳定RNF168，抑制自噬和铁死亡，从而促进肿瘤细胞存活和增殖。靶向抑制TRIM39或RNF168可通过激活自噬和铁死亡抑制肿瘤生长，同时使TNBC细胞对化疗处理敏感。

对RNF168的调控效应更为显著，而TRIM39在TNBC细胞中的高表达与正常细胞相比显示出显著特异性。因此，TRIM39适合作为诊断和预后标志物，而RNF168更适合作为治疗靶点。靶向TRIM39-RNF168轴，结合铁死亡相关化疗，具有降低毒性和增强治疗效果的潜力。

这项研究不仅深化了对TNBC分子机制的理解，而且为开发新的治疗策略提供了重要的理论基础和实验依据。通过揭示TRIM39-RNF168轴在调控自噬和铁死亡中的关键作用，本研究为改善TNBC患者预后提供了新的希望和方向。