位点特异性固定化D-氨基酸脱氢酶用于高效合成D-苯丙氨酸：提升生物催化剂的稳定性和可回收性

为解决D-氨基酸脱氢酶(DAADH)固定化效率低、稳定性差的问题，研究人员开展位点特异性共价固定化研究。通过将Ureibacillus thermosphaericus来源的UtDAADH表面丝氨酸定点突变为半胱氨酸，实现与马来酰亚胺功能化树脂的特异性结合。最佳突变体S2C固定化后比活性提高2.1倍，10次循环后仍保持65-70%转化率和50%初始活性，成功应用于200mg规模D-苯丙氨酸合成，收率>88%，为工业化应用提供了高效稳定的生物催化剂。

　　

在生物催化领域，芳香族D-氨基酸(D-AAs)作为手性构建块在制药和精细化工中具有重要价值，其中D-苯丙氨酸(D-Phe)是抗糖尿病药物那格列奈等关键药物的前体。然而，自然界中D-选择性氨基酸脱氢酶(DAADHs)稀少，且酶催化过程需要昂贵的辅因子NADPH再生，限制了其工业化应用。酶固定化技术虽能提高催化剂的回收利用和操作稳定性，但传统的非特异性共价固定往往导致酶活性显著降低。

为了解决这些问题，来自罗马尼亚巴比什-波雅依大学的研究团队在《New Biotechnology》发表了创新性研究成果。他们通过对Ureibacillus thermosphaericus来源的D-氨基酸脱氢酶(UtDAADH)进行理性设计，开发了一种位点特异性固定化策略，显著提高了固定化酶的催化效率和操作稳定性。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：①蛋白质工程技术，通过点突变将表面丝氨酸残基替换为半胱氨酸；②男性酰亚胺-巯基点击化学反应实现酶与功能化载体的特异性结合；③使用Purolite? ECR8415F甲基丙烯酸树脂作为固定化载体；④分析型和制备型高效液相色谱(HPLC)用于产物分析和纯度测定；⑤核磁共振(NMR)用于产物结构鉴定。

3.1. Selection of immobilization sites for UtDAADH

通过对UtDAADH结构分析，研究人员选择了6个位于表面柔性环上的丝氨酸位点(Ser2、Ser58、Ser92、Ser185、Ser192和Ser317)进行半胱氨酸定点突变。这些位点中Ser192距离底物结合腔约14?，Ser92位于辅因子结合腔内。所有突变体都保持了与原始变体相似的热变性曲线，表明突变没有破坏蛋白质的整体折叠。

3.2. Site-specific covalent immobilization of UtDAADH

研究人员开发了位点特异性共价(SC)固定化流程，使用聚乙二醇二缩水甘油醚作为间隔臂，通过对树脂进行氨基功能化和马来酰亚胺活化，实现与酶表面半胱氨酸的特异性结合。所有位点特异性固定化的UtDAADH都表现出高固定化率(>95%)。

3.3. Catalytic efficiency of the site-specifically immobilized UtDAADHs

固定化生物催化剂的比活性(S_a,i)显著低于可溶性UtDAADH，但位点特异性固定化制备物(除S58C外)保留了>21%的自由酶活性，高于非特异性共价(NC)固定化制备物的16.7%。其中S2C和S192C固定化生物催化剂表现出最高比活性，分别为~0.078和~0.083 U/mg，比非特异性共价固定化UtDAADH提高了2.1和2.2倍。

3.4. Recyclability and operational stability of the immobilized biocatalysts

在10个还原胺化反应循环的重复使用性测试中，S2C和S317C固定化制备物表现出最高的操作稳定性，在整个10个反应循环中保持65-70%的转化率。S2C固定化酶在10个循环后仍保留了50%的初始比活性(0.039 μmol/min/mg)，显著优于吸附固定(~60%活性损失)和非特异性共价固定(<10%活性保留)的变体。

3.5. Optimization of biocatalyst-to-substrate ratio

通过优化生物催化剂与底物的比例，研究人员确定使用25μg酶含量(酶/底物摩尔比~1.4×10^-4)可在20小时反应时间内实现苯丙酮酸(PPA)的完全转化(>99%)。

3.6. Preparative-scale reductive amination and synthetic applicability

在制备规模的200mg级反应中，位点特异性固定化的S2C UtDAADH在三个连续的反应循环中均实现了苯丙酮酸的完全转化，分离得到对映体纯的D-苯丙氨酸(ee >99%)，分离产率高达88-92%。

这项研究的结论表明，位点特异性共价固定化策略显著提高了UtDAADH的催化效率和操作稳定性。特别是通过S2C突变体固定的酶制备物表现出最优异的性能，在10个反应循环后仍保持高转化率和活性保留率。成功应用于制备规模的D-苯丙氨酸合成，证明了该方法在工业化生产中的巨大潜力。

该研究的讨论部分强调，位点特异性固定化通过控制酶分子的取向，减少了传统多价共价固定可能引起的结构刚性化问题，从而更好地保持了酶的催化活性。特别是固定位点的选择对酶活性有重要影响，位于催化结构域闭合区域远端的位点(如S2C和S317C)更有利于保持酶的催化功能。

这项研究为DAADH的工业化应用提供了高效稳定的固定化生物催化剂，解决了传统固定化方法活性损失大的问题。同时，该策略为开发连续流多酶级联反应生产D-苯丙氨酸奠定了基础，对推动生物催化在手性氨基酸合成中的应用具有重要意义。位点特异性固定化方法也可推广到其他工业酶的应用中，具有广泛的适用性和重要的实践价值。