毛状根快速转化系统解析柱花草铝抗性中 haloacid dehalogenase (SgHAD1) 的代谢调控机制

本研究开发了首例柱花草（Stylosanthes）毛状根转化系统，通过SgHAD1基因过表达揭示了其通过水解G6P/F6P调控糖信号、有机酸（如苹果酸、柠檬酸）及黄酮类代谢通路，显著增强植物铝抗性（Al-tolerance），为作物抗铝毒基因工程提供了新策略。

　　

Section snippets

Plant and bacteria materials

本研究使用圭亚那柱花草（S. guianensis）品种热研5号（Reyang No.5）和细茎柱花草（S. gracilis）种质TF0040，均由热带作物遗传资源研究所提供。五种根癌农杆菌（A. rhizogenes）商业菌株（Ar 1193、MSU4404、C58C1、Ar Qual、K599）购自上海韦迪生物科技有限公司。

Identification of transgenic hairy roots

毛状根初筛采用便携式激发光源（LUYOR-3415RG）检测荧光信号。

Procedure for A. rhizogenes-mediated hairy root transformation in stylo

柱花草毛状根转化流程如图1所示：

A）将细茎柱花草与圭亚那柱花草种子置于2 mL离心管中，加入无菌水后80℃热激3分钟，弃水后用75%乙醇灭菌3分钟，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞处理10分钟，最后用无菌水冲洗5次。

B）灭菌后的种子接种于1/2 MS固体培养基，25℃黑暗培养3天直至萌发。

C）取幼苗下胚轴切段作为转化外植体。

D）将外植体浸泡于活化至OD600=0.6的农杆菌菌液中10分钟，用无菌滤纸吸干后共培养于MS固体培养基（含200 μM乙酰丁香酮）。

E）共培养2天后，外植体转移至含500 mg/L头孢霉素的MS培养基以抑制农杆菌生长。

F）培养10天后，外植体基部产生毛状根。

G）切取毛状根尖端接种于含 Hygromycin B（潮霉素）的MS培养基进行抗性筛选。

H）PCR鉴定阳性转基因毛状根。

Selection of A. rhizogenes strains and plant materials for establishing transgenic hairy root systems

根癌农杆菌中Ri质粒的特性是决定感染成功率的关键因素。不同菌株携带的Ri质粒差异导致其物种感染能力存在变异。本研究比较多种根癌农杆菌菌株在细茎柱花草中的毛状根诱导能力，发现……

Conclusion

我们开发了细茎柱花草的高效转基因毛状根诱导系统，并建立了从其转基因毛状根中分离原生质体的方案。该系统可用于候选基因亚细胞定位、功能代谢通路分析和铝抗性表型鉴定。