核苷逆转录酶抑制剂通过抑制长散在核元件-1激活cGAS-STING通路减轻血管钙化

本刊推荐：为解决血管钙化(VC)缺乏有效治疗策略的问题，研究人员开展了关于长散在核元件-1(LINE1)在VC中作用机制的主题研究。研究发现LINE1在钙化血管中显著上调，通过cGAS-STING通路介导炎症反应促进VC。使用核苷逆转录酶抑制剂(NRTIs)抑制LINE1可有效缓解VC，临床研究证实NRTIs使用是VC的独立保护因素。该研究为VC治疗提供了新的靶点和治疗策略。

　　

血管钙化(vascular calcification, VC)是血管壁中羟基磷灰石晶体的异常沉积，是慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)、糖尿病和动脉粥样硬化患者心血管事件和死亡风险增加的重要病理特征。随着人口老龄化进程加速和慢性疾病患病率上升，VC的全球疾病负担日益加重。然而，由于VC发生发展的分子机制尚未完全阐明，目前临床上缺乏有效阻止或逆转VC的治疗手段。

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)向成骨样细胞的转分化是VC的核心环节，这一过程涉及收缩表型标志物(如SM22α和Smoothelin)的下调和成骨标志物(如Runx2和骨桥蛋白(OPN))的上调。多种病理机制参与调控VSMCs的成骨转分化，其中炎症反应被认为是关键驱动因素之一。然而，介导VC炎症反应的上游信号事件仍不清楚。

近年来，转座元件(transposable elements, TEs)在衰老相关细胞变化中的作用备受关注。长散在核元件-1(long interspersed nuclear element-1, LINE1)是人类基因组中最大的自主移动转座元件，约占基因组的21%。在衰老和各种病理状态下，LINE1可以被激活，导致基因组不稳定、DNA损伤和炎症反应，这些过程都与VC的发生发展密切相关。此外，LINE1激活与类风湿性关节炎、干燥综合征和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中的炎症反应有关。然而，LINE1在VC环境中是否发生变化以及是否通过促进炎症激活影响VC的起始和进展尚不清楚。

核苷逆转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitors, NRTIs)是一类人工合成的核苷类似物，作为病毒逆转录酶的竞争性阻滞剂，已获批用于治疗乙型肝炎和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染，患者耐受性良好。此外，NRTIs还被证明可以抑制LINE1的反转录酶活性，可能有助于减轻炎症效应。但是，NRTIs是否调控VC过程仍有待研究。

发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》的这项研究通过整合临床样本分析、体内外实验验证和机制探讨，揭示了LINE1在VC中的关键作用及其分子机制，并评估了NRTIs作为VC治疗策略的临床转化潜力。

研究人员采用的技术方法主要包括：临床冠状动脉和主动脉弓钙化评分(Agatston score)、血管组织免疫组化染色和免疫荧光染色、体外VSMCs钙化模型(高磷诱导)、两种小鼠VC模型(慢性肾脏病诱导和维生素D₃超负荷)、RNA测序分析、Western blot蛋白检测、染色质免疫沉淀qPCR(ChIP-qPCR)以及一项涉及1785名参与者的临床横断面研究。

LINE1表达与CKD患者VC发生率呈正相关

研究人员首先检测了37例CKD患者外周血单核细胞(PBMCs)中LINE1 mRNA水平，发现VC患者LINE1表达显著上调(1.61 vs. 4.63, P<0.001)，且与VC Agatston评分呈强正相关(P<0.001)。免疫组化染色显示，钙化的人桡动脉中LINE1-ORF1表达明显升高，且伴有Runx2水平升高。免疫荧光染色进一步证实，钙化动脉中层LINE1表达显著升高并伴随Runx2水平增加。这些数据表明LINE1在伴有VC的CKD患者中增加。

LINE1在钙化VSMCs和小鼠主动脉中上调

在体外，高磷(Pi)成功诱导VSMCs钙化。研究人员发现钙化VSMCs的细胞质和细胞核组分中LINE1 DNA水平显著升高。LINE1 mRNA在细胞质和细胞核区室中也检测到显著上调。Western blot分析显示，随着Pi给药剂量的逐渐增加，LINE1-ORF1逐渐上升，同时成骨表型标志物(OPN和Runx2)上调和收缩表型标志物(SM22α和Smoothelin)下调。在高腺嘌呤饮食或维生素D₃(VitD₃)超负荷建立的两种VC小鼠模型中，Western blot分析显示钙化主动脉中LINE1-ORF1表达显著增加，伴有OPN和Runx2上调和Smoothelin和SM22α下调。免疫组化结果显示钙化CKD小鼠动脉中LINE1和Runx2增加。类似地，Western blot分析和免疫组化显示VitD₃超负荷小鼠中LINE1-ORF1升高。这些结果表明LINE1表达在钙化VSMCs和小鼠动脉中均存在升高。

抑制LINE1减轻VSMCs钙化

为探究LINE1在VC中的作用，研究人员通过转染siRNA靶向LINE1(si-LINE1)来敲低VSMCs中的LINE1表达。茜素红染色和钙含量测量显示LINE1敲低有效减少了钙沉积。Western blot分析显示LINE1敲低抑制了成骨标志物表达，同时促进了收缩标志物表达。研究人员进一步研究了NRTIs在VC中的作用，发现NRTIs显著降低了VSMCs中LINE1 DNA和mRNA水平。如预期那样，茜素红染色和钙含量测量显示NRTIs处理的VSMCs表现出显著的剂量依赖性钙沉积减少。类似地，NRTIs抑制了成骨标志物表达但促进了收缩标志物表达，VSMCs中LINE1-ORF1降低。研究人员还探讨了另一种NRTIs药物恩替卡韦在VC中的作用，钙含量测量、茜素红染色和Western blot结果证实恩替卡韦抑制VC。这些结果证实抑制LINE1延迟了VSMCs钙化。

NRTIs抑制LINE1减轻CKD诱导和VitD3超负荷钙化小鼠模型中的VC

前述结果表明NRTIs抑制VSMCs中LINE1表达。因此，研究人员给小鼠施用NRTIs以评估LINE1对VC的影响。结果显示NRTIs治疗显著延长了CKD小鼠的寿命。然而，肌酐和血尿素氮(BUN)水平显示NRTIs治疗组和对照组之间肾功能没有显著差异。此外，Masson染色和纤维化标志物表达显示组间肾纤维化没有显著差异。主动脉整体茜素红染色显示NRTIs有效减少了CKD和VitD₃超负荷小鼠的VC。降主动脉切片的Von Kossa染色显示NRTIs显著减轻了两种小鼠模型中的VC。此外，钙含量检测证实NRTIs可以降低两种不同VC小鼠模型的主动脉钙含量。Western blot分析证实NRTIs抑制了CKD小鼠中LINE1-ORF1表达。NRTIs治疗显著降低了OPN和Runx2表达，同时增加了Smoothelin和SM22α水平。在VitD₃超负荷小鼠中通过Western blot分析观察到一致的结果。此外，免疫组化结果显示NRTIs有效抑制了CKD和VitD₃超负荷小鼠中LINE1-ORF1和Runx2的表达。这些结果表明NRTIs可能通过抑制体内LINE1激活来减轻VC。

抑制LINE1下调cGAS-STING通路和炎症基因

为探究LINE1调控VC涉及的基因和相关信号通路，研究人员对Pi诱导的VSMCs进行了批量RNA测序，这些细胞通过si-LINE1或NRTIs抑制了LINE1。与对照组相比，si-LINE1或NRTIs组VSMCs中差异表达基因(DEGs)显示在火山图中。热图显示，在si-LINE1和NRTIs组中，LINE1抑制后成骨基因显著下调，而收缩基因在si-LINE1和NRTIs组中有效增加。研究人员随后分析了si-LINE1和NRTIs干预共同改变的常见DEGs。维恩图显示两组之间有1762个常见DEGs。基因本体分析表明，si-LINE1和NRTIs干预改变的常见DEGs主要富集在免疫系统和传染病，尤其是病毒感染，其次是细菌感染和免疫疾病。此外，si-LINE1和NRTIs组的DEGs更多与免疫和感染相关。从常见DEGs中识别出的最显著的KEGG通路是细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。细胞因子通过与特定受体相互作用在调节免疫反应、炎症和凋亡中起关键作用。细胞因子-细胞因子受体相互作用通路的失调与VC密切相关。这些结果表明LINE1抑制通过抑制炎症延迟钙化。

为进一步研究LINE1抑制抑制炎症和延迟钙化的机制，研究人员分析了LINE1抑制影响的基因。热图显示，无论是si-LINE1转染还是NRTIs治疗后，cGAMP合酶(cGAS)和干扰素基因刺激因子(STING)均显著下调。cGAS-STING在介导炎症反应中至关重要，其激活与各种心血管疾病有关。值得注意的是，最近的一项研究表明STING敲除减轻了糖尿病相关VC小鼠模型中的VC。此外，热图表明，与对照组相比，si-LINE1或NRTIs抑制LINE1后，cGAS-STING通路内的多个基因和下游炎症因子显著降低。这些结果表明cGAS-STING介导的炎症反应可能是LINE1调控VC的基本机制。

cGAS-STING通路激活和过度炎症是VC所必需的

RNA-seq分析显示cGAS-STING通路和炎症反应可能有助于LINE1对VC的调控，研究人员评估了Pi诱导的VSMCs中与cGAS-STING信号通路相关的因子。Western blot显示，cGAS-STING涉及的分子以Pi剂量依赖的方式显著增加。免疫荧光也显示钙化的人桡动脉中cGAS和STING表达增加。此外，研究人员检测了Pi诱导的VSMCs和CKD模型小鼠中2'3'-环GMP-AMP(cGAMP)水平(第二信使)，发现钙化组中cGAMP水平有效增加。接下来，研究人员评估了与VC和cGAS-STING通路密切相关的几个炎症因子，包括Pi诱导的VSMCs和CKD小鼠血清中的因子。qPCR显示钙化VSMCs中参与cGAS-STING信号的炎症分子mRNA表达显著增加，CKD小鼠血清中相关炎症介质浓度增加。研究证明NLRP3炎症小体和NF-κB增强促炎细胞因子的合成，从而通过RANKL和BMP2的异常表达刺激VSMCs中的成骨活性。这些数据暗示cGAS-STING信号级联和炎症在VC中被触发。

研究人员试图确定cGAS-STING通路是否有助于促进过度炎症，从而导致VC。他们使用cGAMP(STING的特异性激活剂)和H-151(STING的特异性拮抗剂)进一步干扰VSMCs中的通路。研究人员检测了钙化VSMCs中几种炎症分子的mRNA水平，发现cGAMP组中显著增加，但H-151组中显著降低。这些结果表明VC中的过度炎症可能是由于cGAS-STING通路的刺激所致。此外，研究人员探讨了cGAMP和H-151对VC的影响。值得注意的是，茜素红染色和钙含量分析显示cGAMP加速了VSMCs中的钙沉积，而H-151减轻了钙沉积。额外的Western blot结果表明cGAMP显著增强了与成骨表型相关分子(Runx2)的表达，但降低了收缩标志物(Smoothelin和SM22α)的水平，而H-151逆转了Pi中VSMCs的成骨变化。总之，这些发现表明cGAS-STING信号轴的刺激有助于VC中观察到的炎症增强，最终促进其进展。

LINE1通过激活cGAS-STING通路加剧炎症并导致VC

基于这些发现，研究人员接下来研究LINE1是否是导致过度炎症的初始因素，以及cGAS-STING是否参与这一过程。Western blot显示NRTIs抑制了钙化VSMCs中cGAS-STING分子的上调。研究人员使用siRNA沉默VSMCs中的LINE1表达。Western blot结果显示钙化VSMCs中参与cGAS-STING表达的分子水平被si-LINE1抑制。为进一步确认LINE1诱导的cGAS-STING激活是否有助于VC中的炎症，研究人员抑制了LINE1，并检测了钙化VSMCs中与cGAS-STING信号级联相关的炎症介质的mRNA表达。qPCR结果显示，通过NRTIs或si-LINE1抑制LINE1显著降低了这些介质。研究人员还通过Western blot验证了NRTIs对CKD和VitD₃超负荷小鼠主动脉中cGAS-STING轴和下游炎症分子的抑制作用，并通过ELISA验证了小鼠血清中的抑制作用。研究人员随后过表达了LINE1，Western blot结果显示cGAS-STING信号轴在LINE1过表达后显著激活，但被NRTIs显著抑制。鉴于这些发现，研究人员假设LINE1过度激活可能通过VSMCs细胞质中其基因组成分的积累触发细胞质DNA传感器cGAS。因此，这启动了整个cGAS-STING信号轴的事件级联，从而产生促炎细胞因子并最终促进VC。研究人员因此使用染色质免疫沉淀qPCR(Chip-qPCR)检测细胞质中cGAS和LINE1之间的相互作用。细胞质LINE1 cDNA与cGAS的结合在钙化VSMCs中显著更高。这种结合在LINE1过表达后进一步显著增强，但在NRTIs治疗后显著降低。此外，由于LINE1过表达，研究人员通过抑制剂H151敲低cGAS或抑制cGAS-STING信号轴。如茜素红染色、钙含量测量和Western blot分析所示，LINE1过表达显著加剧了VC。然而，这种效应在cGAS敲低或H151处理后显著逆转。总之，这些发现表明LINE1可能是VC中炎症增加的初始贡献者，这归因于cGAS-STING的启动。

临床研究显示NRTIs与较低VC发生率独立相关

一项横断面临床研究进一步调查NRTIs在VC中的参与。本研究纳入了1785名参与者，男性占68.5%，平均年龄51.58岁。总共801名患者定期接受NRTIs治疗，但984名没有。值得注意的是，服用NRTIs的患者VC患病率低于未服用者(25.2% vs 35.4%, P<0.001)。此外，如表1所示，在1-100(轻度)、100-400(中度)和>400(重度)的所有分层中，服用NRTIs人群的冠状动脉和主动脉弓钙化评分低于未服药组。考虑到VC与衰老和CKD的已建立关联，研究人员比较了普通人群、60岁以上个体和CKD患者中使用或不使用NRTIs的VC发生率。值得注意的是，NRTIs治疗的患者在所有亚组中均呈现显著较低的VC患病率，包括总体人群、老年个体和CKD患者。

为阐明NRTIs与VC之间的关联，研究人员进行了单变量和多变量逻辑回归分析。表2证明NRTIs的使用与多个调整模型中VC患病率降低独立相关。在模型1中，未调整的比值比(OR)为0.604(95% CI: 0.492-0.743, P<0.001)。模型2显示，在调整性别、年龄、糖尿病状况、CKD、CVD、高血压、eGFR和体重指数后，比值比(OR)为0.587(95% CI: 0.451-0.764, P<0.001)。模型3进一步纳入了脂质参数(甘油三酯、低密度和高密度脂蛋白、载脂蛋白和总胆固醇)和肌酐，得出的OR为0.555(95% CI: 0.418-0.737, P<0.001)。在最终分析中，对模型3中的所有变量以及肝功能标志物(总胆红素和直接胆红素、AST、ALT)和血液学参数(血红蛋白和血小板)进行了调整，得出的OR为0.555(95% CI: 0.418-0.737, P<0.001)。

采用多变量逻辑回归分析探讨LINE1抑制剂NRTIs与VC严重程度之间的关联，以钙化评分为评估基础。表3中的结果显示，与未服药组相比，服用NRTIs的患者主动脉和冠状动脉钙化风险显著降低，并且这种风险降低在不同严重程度的钙化中均观察到，包括1-100(轻度)、101-400(中度)和>400(重度)的分层。这些发现表明NRTIs使用是VC预防的独立保护因素。

为识别可能从NRTIs治疗中受益的人群，研究人员随后进行多变量逻辑回归分析NRTIs使用者与非使用者在不同亚组中的VC风险，调整了传统VC风险因素。如表4所示，在60岁以上患者(OR 0.410; 95% CI: 0.256-0.685; P=<0.001)和60岁以下患者(OR 0.654; 95% CI: 0.455-0.939; P=0.021)中，NRTIs使用者的VC风险显著低于非使用者。在患有CKD(OR 0.383; 95% CI: 0.181-0.812; P=0.012)和不患有CKD(OR 0.628; 95% CI: 0.476-0.830; P=0.001)的人群中，使用NRTIs的个体表现出比非使用者显著降低的VC风险。在没有糖尿病(OR 0.555; 95% CI: 0.407-0.756; P<0.001)或没有CVD(OR 0.500; 95% CI: 0.349-0.715; P<0.001)的个体中，使用NRTIs的个体VC风险显著降低。然而，在患有糖尿病或CVD的人群中，NRTIs使用者和非使用者之间的钙化风险没有差异。

总之，研究结果表明NRTIs治疗与较低的发生率和严重程度的VC相关。这些发现暗示NRTIs可能是VC预防和管理的有前途的治疗选择。

研究结论与意义

本研究阐明了LINE1在VC中的关键作用。研究发现LINE1在CKD患者和小鼠的钙化动脉中显著上调。值得注意的是，LINE1抑制在体外和体内减轻了VC。机制上，批量RNA序列分析表明LINE1抑制下调了钙化VSMCs中cGAS-STING信号级联及其调控的下游炎症基因。进一步的干预实验证实cGAS-STING信号通路的启动和过度炎症对VC的进展至关重要。此外，研究人员认识到钙化VSMCs中的细胞质LINE1 cDNA是触发cGAS-STING通路的关键组成部分。在临床研究中，研究人员进一步证实NRTIs的使用与较低的VC患病率独立相关，突出了它们作为治疗候选药物的潜力。

先前的研究表明LINE1表达在衰老细胞和生物体中增加，表明其作为年龄相关疾病驱动因素的潜在作用。然而，LINE1与VC之间的关系，后者是CKD患者血管老化的表现，仍不清楚。研究显示中风和缺血性心脏病患者循环系统中LINE1水平升高。本研究与这些发现一致，证明LINE1在人类和小鼠的VC中上调，并且LINE1与钙化严重程度呈正相关。研究结果得到一项涉及794名2型糖尿病患者的队列研究的支持，该研究表明LINE1甲基化升高与舒张压、eGFR和HDL胆固醇比率降低相关。这些关联强调了LINE1与VC之间的潜在联系，并突出了LINE1在VC中的新作用。

最近，调节LINE1激活作为减轻衰老的手段在生命科学中受到越来越多的关注。先前的研究证明，通过NRTIs抑制LINE1反转录酶活性或通过短发夹RNA或siRNA沉默LINE1表达有效降低细胞LINE1水平并减轻衰老相关表型。此外，LINE1特异性反义寡核苷酸治疗已显示降低LINE1 RNA水平，从而改善衰老标志物的表达。值得注意的是，VC通常随着衰老而恶化。然而，LINE1抑制是否可以直接减轻VC仍有待阐明。研究结果表明，通过siRNA敲低LINE1或施用NRTIs显著减少VSMCs中的成骨转分化。此外，在CKD和VitD₃超负荷小鼠模型中，NRTIs治疗有效减轻了VC。据报道，钙和磷酸盐升高导致异染色质丢失，从而导致VC。沉默LINE1与这些位点的异染色质化有关，表明增加的磷酸盐可能通过调节异染色质的丢失影响LINE1。此外，异染色质化过程涉及染色质重塑酶的激活和效应蛋白的招募。作为维持异染色质的关键蛋白之一，SIRT6可以有效地抑制LINE1表达。此外，SIRT6在高磷酸盐水平或其他钙化相关因子条件下被抑制，SIRT6的缺失加剧了VC。因此，高Pi可能通过抑制SIRT6介导的异染色质丢失激活LINE1，进而促进VSMCs钙化。这可能是Pi激活LINE1的机制之一。总之，这些结果强调了LINE1在VC进展中的关键作用，并支持LINE1干预在减轻VC中的治疗潜力。

LINE1的失调与先天免疫反应的刺激有关，可能导致DNA损伤和细胞死亡，最终促进细胞衰老。然而，LINE1抑制减轻VC的确切机制仍不清楚，转录组分析提供了关键见解。来自通过siRNA或NRTIs抑制LINE1的钙化VSMCs的批量RNA-seq结果显示炎症相关反应显著下调。这一观察结果与炎症是VC标志的既定理解一致，尽管介导VC中异常炎症状态的具体分子通路尚未完全阐明。研究结果强调cGAS-STING激活和随后的炎症级联反应是VC所必需的。LINE1失调诱导的cGAS-STING过度激活在衰老过程中起关键作用。此外，研究人员发现钙化VSMCs细胞质中LINE1 cDNA与cGAS的结合显著增加，经ChIP-qPCR证实，这被NRTIs治疗减轻。重要的是，siRNA和NRTIs均显著逆转cGAS-STING信号级联的启动，减轻VC中的炎症。总之，研究证明了cGAS-STING介导的钙化VSMCs炎症环境调控，并强调LINE1衍生DNA作为炎症和VC的重要贡献者。

NRTIs长期以来因其治疗乙型肝炎和HIV的功效而闻名。然而，最近的研究促使重新评估它们在抗病毒治疗之外的潜力，特别是在与衰老和相关疾病有关的方面。值得注意的是，NRTIs有能力减轻各种细胞和动物模型中的衰老过程，如在BMAL1敲除人间充质干细胞和SIRT6敲除小鼠中的发现所证明。临床上，数据表明接受NRTI治疗的患者发生高血压(25.89% vs. 15.1%)、高甘油三酯血症(10.01% vs. 6.59%)、高胆固醇血症(2.17% vs. 1.26%)和缺血性心脏病(4.15% vs. 2.12%)的风险显著低于未使用这些药物的患者。重要的是，涉及1785名个体的本研究揭示了NRTIs使用与降低VC之间的新关联。研究人员将NRTIs确定为VC的独立保护因素。然而，在糖尿病人群中，NRTIs使用者和非使用者之间的钙化风险没有显著差异。事实上，糖尿病人群和CKD人群的VC机制不同。在糖尿病患者中，在高血糖和胰岛素抵抗条件下，钙化主要涉及晚期糖基化终末产物(AGEs)沉积和内皮功能障碍。这些效应物诱导VSMCs向成骨样细胞转换并加速钙盐沉积。在CKD患者中，VC与肾功能下降、磷负荷增加、维生素D代谢异常和钙磷稳态紊乱更密切相关。因此，糖尿病人群和CKD人群之间VC的不同机制可能解释了为什么在糖尿病亚组中没有观察到NRTIs的保护作用。此外，先前的流行病学研究强调，在128,861名HIV-1或乙型肝炎患者队列中，NRTIs使用与糖尿病风险降低33%相关。此外，对72,193名没有阿尔茨海默病病史的HIV