新型帘蛤多肽靶向癌细胞凋亡、自噬及FGF19-FGFR4信号通路的抗肿瘤机制研究

本研究针对肝癌(HCC)和结直肠癌(CRC)治疗中化疗药物选择性差、毒性大的问题，从食用双壳贝类Ruditapes decussatus中分离纯化多肽混合物，通过FPLC色谱和de novo测序鉴定出135种肽段，其中57种具抗癌潜力。实验表明Fraction 2和3可选择性诱导癌细胞凋亡（下调Bcl-2、上调caspase-3）和自噬（增加Beclin-1），并抑制FGF19-FGFR4信号通路，为开发海洋源靶向抗癌药物提供了新策略。

　　

癌症是全球健康的重要威胁，2020年记录到1930万新病例和1000万死亡病例。肝细胞癌(HCC)和结直肠癌(CRC)尤其常见且严重，HCC在全球男性中排名第三、女性中排名第八，CRC总体诊断率第三。化疗仍是现代肿瘤学的主要手段，但缺乏选择性导致严重毒副作用。近年来，海洋生物活性肽因具有选择性细胞毒性、小分子量、结构适应性和跨膜能力等优势，成为抗癌药物开发的 promising 候选者。海洋双壳贝类如Ruditapes decussatus（一种常见食用贝）含有未经深入研究的生物活性化合物，本研究旨在探索其多肽的抗癌潜力。

研究人员从埃及苏伊士运河地区Lake Timsah采集R. decussatus样本，提取软组织并通过三氯乙酸-丙酮沉淀法稳定蛋白质，使用3 kDa分子量截留滤器浓缩后，采用FPLC强阴离子交换色谱纯化肽段混合物，获得三个组分（Fraction 1-3）。通过Orbitrap Exploris 480质谱仪进行UHPLC分离和de novo测序（使用novor.cloud工具），并通过AntiCP 2.0平台预测抗癌活性。细胞实验使用人肝癌HepG2和结直肠癌HT-29细胞系，以及正常人肝细胞(HHC)和VERO肾细胞，通过MTT法评估细胞毒性和IC₅₀，qPCR检测凋亡（Bcl-2、caspase-3）、自噬（Beclin-1）和FGF19-FGFR4信号通路基因表达，流式细胞术分析细胞凋亡率和周期分布，细胞形态学通过H&E染色评估。

Peptide extraction and purification

FPLC色谱显示三个洗脱峰（Fraction 1-3），其中Fraction 2和3浓度较高（46±2和140±4.4 μg/mL），用于后续分析。Fraction 1因浓度低（<1 μg/mL）被排除。

Sequencing of collected fractions using mass spectrometry and de novo analysis

质谱分析Fraction 2鉴定出4种肽段，匹配到R. decussatus的细胞色素c氧化酶亚基1（Cytochrome c oxidase subunit 1）蛋白。Fraction 3通过de novo测序鉴定出135种肽段（分子量2681.6–5925.12 Da），AntiCP 2.0预测其中57种（42%）具抗癌潜力（得分>0.5），平均得分0.62±0.09。肽段Pep25（序列KLAHRRRSKPKKWWWQGARNWWRWWWRRRRFF）得分最高（0.83）。肽混合物整体亲水性强（0.12±0.6）、带正电（净电荷3.9±5.9）、等电点pI 8.7±2.98。

Comprehensive evaluation of PFs: testing of cell viability,toxicity

MTT实验显示Fraction 2和3对正常细胞（HHC和VERO）毒性可忽略，但对癌细胞有显著抑制作用。Fraction 2对HepG2和HT-29的IC₅₀分别为32.34 μg/mL和11.51 μg/mL，Fraction 3分别为30.13 μg/mL和7.467 μg/mL，表明对CRC细胞（尤其HT-29）活性更强。

Quantitative detection of apoptotic and autophagy markers

qPCR显示，在HepG2和HT-29细胞中，Fraction 2和3处理下调抗凋亡基因Bcl-2和癌症进展标志FGFR4、FGF19（F-19），上调促凋亡基因caspase-3和自噬基因Beclin-1，表明肽段通过诱导线粒体途径凋亡和自噬介导的细胞死亡抑制癌细胞。

Evaluation of fractions' treatment impacts on cancer cells through flow cytometry

流式细胞术显示，Fraction 2和3处理72小时后，HepG2和HT-29细胞早期和晚期凋亡率显著增加（Fraction 2在HepG2中总细胞死亡39.11%，HT-29中31.88%；Fraction 3分别为28.91%和27.31%），且Fraction 2促凋亡效果更强。细胞周期分析表明肽段诱导HT-29细胞G1/S期阻滞和HepG2细胞G1期延迟，抑制增殖。

Morphological evaluation of fractions' treatment impacts on cancer cells

H&E染色显示，经IC₅₀浓度Fraction 2和3处理的HepG2和HT-29细胞出现核质比降低、细胞分散、凋亡小体和退化特征，印证生化结果。

本研究结论表明，从R. decussatus纯化的肽段（尤其Fraction 2和3）具有选择性抗癌活性，通过诱导凋亡（下调Bcl-2、上调caspase-3）、激活自噬（增加Beclin-1）、抑制FGF19-FGFR4信号通路和引起G1/S期阻滞，有效抑制HepG2和HT-29癌细胞增殖，且对正常细胞毒性低。这些肽段（如高得分肽Pep25）为开发海洋源靶向抗癌药物提供了新候选，尤其对结直肠癌显示突出潜力。未来需开展体内研究验证其药效和安全性，并深入探索分子机制。论文数据已通过ProteomeXchange（标识PXD067801）公开，支持进一步研究。