中性粒细胞胞外诱捕网通过AIM2炎症小体抑制γδ调节性T细胞分化加剧炎症性关节炎

本研究针对炎症性关节炎中γδ Treg细胞功能失调的机制难题，揭示了中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）通过其DNA组分激活AIM2炎症小体-GSDMD通路，诱导线粒体功能障碍和ROS积累，从而抑制γδ Treg细胞分化的新机制。研究人员通过临床样本分析、动物模型验证和分子机制探索，证实靶向NETs形成或补充γδ Treg细胞可显著缓解关节炎症状，为炎症性关节炎治疗提供了新的靶点策略。

在自身免疫疾病的广阔研究领域中，炎症性关节炎（包括类风湿关节炎和强直性脊柱炎）始终是困扰患者和医生的难题。尽管现代医学已经开发出多种生物制剂和小分子靶向药物，仍有相当比例的患者对现有治疗反应不佳，最终面临关节破坏和功能丧失的严峻后果。这种治疗困境的背后，隐藏着免疫系统调控的复杂网络，其中γδ T细胞的功能失调近年来被证实是疾病发生发展的重要推手。特别是具有免疫抑制功能的γδ调节性T细胞（γδ Treg）在患者体内比例显著下降，但导致这种异常分化的深层机制却始终笼罩在迷雾之中。

与此同时，在炎症性关节炎的病理微环境中，大量浸润的中性粒细胞形成了一道独特的"风景线"。这些先天免疫细胞不仅能够直接释放炎性因子，还能通过形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）——一种由解聚染色质和组蛋白构成的网状结构——影响周围免疫细胞的命运。越来越多的证据表明，NETs水平在炎症性关节炎患者中显著升高，且与疾病严重程度密切相关。然而，NETs是否以及如何影响γδ Treg细胞的分化，进而参与疾病进程，仍然是一个待解的科学谜题。

带着这些疑问，研究人员在《Redox Biology》上发表了一项突破性研究，系统揭示了NETs通过AIM2炎症小体通路抑制γδ Treg细胞分化的分子机制，为理解炎症性关节炎的免疫失调提供了全新视角。

为了深入探索这一科学问题，研究团队整合了多层次技术方法：收集了强直性脊柱炎（AS）和类风湿关节炎（RA）患者的临床样本（外周血和病变组织），建立胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型，运用流式细胞术分析免疫细胞亚群，通过RNA测序筛选差异表达基因，采用Western blot和免疫荧光检测关键蛋白表达，并使用线粒体功能检测试剂盒（如JC-1、MitoSOX、TMRE）评估线粒体状态。这些技术的综合应用为机制研究提供了坚实的数据支撑。

NET水平在炎症性关节炎患者和小鼠中升高

研究人员首先检测了AS患者、RA患者和CIA模型小鼠血清及局部病变组织中的NETs水平。免疫荧光染色结果显示，AS患者椎间关节囊和RA患者滑膜组织中MPO和H3Cit（NETs的标志物）表达显著高于对照组。同样，在CIA模型小鼠的踝关节中也观察到NETs的明显浸润。通过ELISA检测血清中MPO-DNA复合物水平，进一步证实了炎症性关节炎患者和小鼠循环系统中NETs水平的升高。这些发现表明，NETs在炎症性关节炎中不仅局部增多，还存在系统性升高。

NETs抑制γδ Treg细胞分化

接下来，研究团队探讨了NETs对γδ T细胞分化的影响。令人惊讶的是，NETs以浓度依赖的方式显著抑制了γδ Treg细胞的分化，同时降低了Foxp3和p-STAT5的表达水平——这两个关键分子是γδ Treg细胞的标志性特征。值得注意的是，NETs对γδ T1或γδ T17细胞的分化没有明显影响。体内实验进一步验证了这一发现：给C57BL/6J小鼠注射NETs后，外周血和脾脏中γδ Treg细胞的比例显著下降。临床样本分析显示，AS和RA患者外周血中γδ Treg细胞的比例确实低于健康供体，CIA模型小鼠中也观察到类似现象。这些结果确立了NETs抑制γδ Treg细胞分化的生物学效应。

抑制NET形成恢复γδ Treg细胞比例并对CIA模型小鼠产生治疗作用

为了评估靶向NETs的治疗潜力，研究人员在CIA模型小鼠中使用了两种作用机制不同的NET抑制剂：sivelestat（SVT，中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂）和CI-amidine（PAD4选择性抑制剂）。两种处理均显著降低了小鼠循环系统和踝关节组织中的NETs水平，同时恢复了外周血、脾脏和踝关节中γδ Treg细胞的比例。更重要的是，NET抑制剂的治疗明显减轻了踝关节肿胀，降低了临床评分，减少了炎症细胞浸润和关节损伤。通过输注体外极化的γδ Treg细胞也观察到类似的治疗效果。这些结果表明，降低NET水平可以恢复γδ Treg细胞分化，从而缓解炎症性关节炎的发展。

NETs通过其DNA成分抑制γδ Treg细胞分化

研究人员进一步探究了NETs发挥作用的活性成分。使用网格蛋白非依赖性内吞（CIE）抑制剂Pitstop 2处理后，γδ T细胞对NETs的内化明显减少，同时NETs对γδ Treg细胞分化的抑制作用也被消除。通过选择性去除NETs的不同组分，发现只有去除DNA组分（而非RNA或蛋白质）才能逆转NETs的抑制效应。Western blot分析显示，DNA酶处理的NETs无法降低Foxp3和p-STAT5的表达水平。更重要的是，直接从NETs中提取的DNA足以浓度依赖性地抑制γδ Treg细胞分化。这些数据明确表明，NETs相关的DNA成分是抑制γδ Treg细胞分化的关键因子。

NETs相关DNA激活AIM2炎症小体抑制γδ Treg细胞分化

通过RNA测序分析，研究人员发现NETs刺激后的γδ T细胞中有221个差异表达基因，其中细胞质DNA传感器AIM2的表达变化最为显著。KEGG分析显示这些基因富集在炎症相关通路中。实验验证表明，NETs或其相关DNA刺激后，γδ T细胞中AIM2表达显著上调，同时下游效应分子NT-GSDMD和活化的Caspase-1 p20亚基水平也明显升高。功能实验证实，使用AIM2抑制剂、敲低AIM2表达或使用AIM2缺陷小鼠的γδ T细胞，都能消除NETs对γδ Treg细胞分化的抑制作用。相反，添加AIM2激活剂则模拟了NETs的抑制效应。这些结果证明了NET相关DNA通过激活AIM2炎症小体通路抑制γδ Treg细胞分化。

AIM2炎症小体激活诱导ROS积累

研究人员进一步探索了AIM2炎症小体下游的效应机制。使用CellROX和MitoSOX探针检测发现，NETs刺激显著增加了γδ T细胞中的总ROS和线粒体ROS（mtROS）水平，而这种效应在AIM2敲低后被消除。使用广谱ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）和线粒体靶向抗氧化剂Mito-TEMPO（mtT）均能有效阻断NET诱导的ROS积累，并逆转NETs对γδ Treg细胞分化的抑制作用。这些结果表明，AIM2炎症小体通过诱导ROS积累来抑制γδ Treg细胞分化。

GSDMD介导线粒体功能障碍导致ROS积累

为了阐明AIM2炎症小体诱导ROS积累的机制，研究人员检测了NETs对线粒体网络结构的影响。MitoTracker染色显示，NETs诱导了γδ T细胞中的线粒体碎片化，这一现象在AIM2缺陷细胞中被完全消除。同时，线粒体分裂标志分子Drp1的磷酸化水平（Ser616位点）显著升高。通过JC-1和TMRE染色评估线粒体膜电位，发现NETs刺激后线粒体膜电位显著下降，而AIM2敲低保持了正常的膜电位水平。Seahorse代谢分析进一步表明，NETs刺激显著损害了γδ T细胞的基线耗氧率和最大线粒体呼吸能力，而AIM2敲低有效挽救了这些代谢缺陷。这些数据证实AIM2炎症小体激活导致线粒体功能障碍。

研究人员还发现，NETs刺激后，GSDMD与线粒体的共定位增强，Western blot检测到NT-GSDMD在线粒体组分中特异性富集。使用GSDMD孔形成抑制剂disulfiram（DSF）处理后，NETs诱导的线粒体膜电位损失被逆转，mtROS和总ROS水平降低，氧化磷酸化能力恢复，最重要的是，DSF alleviated NETs对γδ Treg细胞分化的抑制作用。这些发现表明，AIM2炎症小体效应分子GSDMD通过诱导线粒体功能障碍导致ROS积累。

研究结论与讨论部分强调，这项工作系统揭示了NETs在炎症性关节炎中通过其DNA成分激活AIM2炎症小体-GSDMD通路，诱导线粒体功能障碍和ROS积累，从而抑制γδ Treg细胞分化的新机制。这一发现不仅深化了对炎症性关节炎发病机制的理解，更重要的是提供了潜在的治疗策略：靶向NETs形成（如使用SVT或CI-amidine）或补充γδ Treg细胞都可能成为治疗炎症性关节炎的有效方法。

研究的创新性在于首次将NETs、AIM2炎症小体激活、线粒体功能障碍和γδ Treg细胞分化抑制联系起来，构建了一个完整的病理机制链条。同时，研究也揭示了GSDMD在线粒体功能调节中的新作用，扩展了对炎症小体效应机制的认识。

然而，作者也坦诚指出了研究的局限性：不同炎症性关节炎疾病中NETs的组成和效应可能存在差异；患者来源中性粒细胞形成NETs的潜能需要进一步研究；ROS抑制γδ Treg细胞分化的详细机制仍有待阐明。这些开放性问题为未来研究指明了方向。

总之，这项研究不仅为炎症性关节炎的治疗提供了新的靶点思路，也为理解NETs在免疫调节中的作用贡献了重要见解，具有重要的理论价值和临床转化潜力。