不同储存温度下发酵与未发酵珍珠粟脂肪酸谱的判别分析及其对货架期预测的意义

《Scientific Reports》：Fatty acid profiling for discriminating fermented and non-fermented pearl millet (Pennisetum glaucum L.) grains under different storage temperatures

本研究针对珍珠粟(Pennisetum glaucum L.)因高脂肪含量(5-7%)和强脂酶活性导致的储存易酸败问题，通过乳酸菌(LAB)发酵处理，系统分析了其在5℃、25℃和45℃下储存120天期间的脂肪酸(FA)谱变化。研究人员采用GC-FID技术鉴定出23种脂肪酸，发现发酵显著改善了不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例(从3.43升至3.57)，并通过oPLS-DA和sPLS-DA等多变量分析方法成功区分了不同储存条件下的样品。研究证实脂肪酸分析可作为监测谷物品质变化的有效工具，为制定精准储存方案和确定最佳食用期限提供了科学依据。

　　

在非洲和亚洲地区，珍珠粟(Pennisetum glaucum L.)是数百万贫困人口和小农户的主食，这种谷物富含能量、碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素和矿物质。尤为突出的是，珍珠粟的脂肪含量高达5-7克/100克，且脂肪消化率优于其他谷物。其脂质中含有大量多不饱和脂肪酸(PUFAs)，如亚油酸(ω-6)和α-亚麻酸(ω-3)，这些是人类无法自行合成的必需脂肪酸。多不饱和脂肪酸在珍珠粟总脂肪酸中占比达50%，是主要的脂质组分。此外，谷物脂质还是 unsaturated fatty acids (USFAs) 的主要来源，已知对降低心血管风险、改善认知功能和调节血糖指数具有多种健康益处。

尽管营养丰富，珍珠粟的潜力却因保质期短而受限。储存过程中产生的酸败和异味阻碍了其更广泛的消费者接受度。与其他谷物不同，珍珠粟即使以完整颗粒形式储存也容易变质。新鲜珍珠粟整粒的保质期仅为3-4个月，而面粉的保质期更短，只有7-8天。高脂肪含量加上高脂酶活性导致珍珠粟脂肪在储存过程中水解成游离脂肪酸(FFA)，进而引发酸败。为了延长珍珠粟粉的保质期，研究人员尝试了多种加工方法，包括添加抗氧化剂、干热、蒸煮、微波和红外加热处理、发芽以及发酵。

珍珠粟在储存期间风味和异味的恶化主要归因于脂质氧化，该过程主要影响亚油酸(ω-6)和亚麻酸(ω-3)等不饱和脂肪酸，产生异味并降低营养价值。脂质氧化最初通过自动氧化或酶促氧化将非反应性脂肪酸转化为反应性脂质过氧化物，进而产生羰基化合物，如醛类和酮类。发酵作为一种古老的谷物和豆类加工技术，被证明可以提高营养价值并延长保质期。在乳酸菌发酵过程中，有益微生物将复杂分子分解为更小的分子，易于消化，并能改善氨基酸谱、矿物质生物利用度、维生素B和脂肪酸谱，同时降低单宁、植酸和脂酶活性等抗营养因子。

尽管密闭储存技术自古有之，但其通过限制氧气、水分和害虫接触来保持谷物品质和保质期的有效性在现代研究中得到证实。对于珍珠粟这类高脂肪谷物，密闭储存尤为重要，它能减缓不饱和脂肪酸的氧化，抑制脂酶活性，从而降低酸败风险。然而，目前关于不同储存条件下谷物脂肪酸谱的研究有限，特别是关于 submerged lactobacillus fermentation（浸没式乳酸菌发酵）对珍珠粟脂肪酸谱影响的研究尚属空白。因此，本研究旨在评估不同储存温度和时长下，生料和发酵珍珠粟颗粒的脂肪酸特性变化。

本研究采用气相色谱-火焰离子化检测(GC-FID)技术进行脂肪酸分析，并通过主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、稀疏偏最小二乘判别分析(sPLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(oPLS-DA)等多变量统计方法对数据进行分类和判别。样本为市售珍珠粟颗粒，经乳酸菌在豆腐乳清培养基中发酵后，于不同温度(5°C、25°C、45°C)下密闭储存120天，并在特定时间点(0、60、120天)提取脂质进行测定。

总脂质和储存期间发酵与未发酵谷物中的脂肪酸

发酵使珍珠粟样品的粗脂肪含量从5.18%显著降低至4.34%。在储存期间，从生料和发酵谷物中共鉴定出23种脂肪酸化合物。珍珠粟谷物含有高水平的 unsaturation（不饱和度）(包括单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸)，占总脂肪酸含量的77.27%至78.40%，是必需脂肪酸的优质来源。在所有储存温度下，不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值在3.40至3.57之间波动，大于2.5，被认为是营养丰富的产品。

在储存开始时，生珍珠粟脂质主要由44.04%的亚油酸(C_18:2n6c)、28.9%的油酸(C_18:1n9c)、18.48%的棕榈酸(C_16:0)、2.8%的硬脂酸(C_18:0)和2.36%的α-亚麻酸(C_18:3n3)组成。发酵珍珠粟颗粒则主要含有亚油酸(45.1%)，其次是油酸(29.91%)、棕榈酸(18.38%)、硬脂酸(0.78%)和α-亚麻酸(2.45%)。豆腐乳清基质微生物发酵16小时导致亚油酸、油酸和α-亚麻酸含量显著增加，而棕榈酸和硬脂酸含量显著减少。发酵过程将不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率从3.43提高至3.57。在储存末期(120天)，发酵样品显示出略高的脂肪酸含量，这可能与发酵过程中脂解酶活性增强有关。生谷物中亚油酸、油酸和α-亚麻酸的高浓度表明其比发酵谷物更容易发生酸败。

发酵对脂质谱的影响

发酵过程对珍珠粟谷物的脂肪酸谱产生了显著影响。在发酵过程中，观察到总脂质、非极性和极性脂质组分的脂肪酸发生了变化。极性脂质组分中最丰富的脂肪酸是亚油酸(C_18:2n6c)，而非极性组分的主要部分则是油酸(C_18:1n9c)。在后续发酵阶段，脂肪酸的非极性组分含量增加。这可能是由于乳酸菌在豆腐乳清培养基中发酵时形成了油酸等脂肪酸。乳酸菌在生长迅速的豆腐乳清培养基中会掺入外源性游离多不饱和脂肪酸，这可能影响了具有20至22个碳和18个碳且具有共轭双键的多不饱和脂肪酸的比例，以及观察到的乳酸菌生长培养基中脂肪酸的不饱和度和环化程度。

储存期间温度和储存时间对脂肪酸谱的影响

温度和时间是影响珍珠粟谷物储存的最重要环境因素。在本研究中，储存在25°C和45°C下的谷物比储存在5°C下的谷物显示出更高相对百分比面积的亚油酸(18:2 ω-6)。另一方面，与储存初始阶段或低温(5°C)相比，在生料和发酵谷物中，油酸、棕榈酸和硬脂酸的浓度随着温度和时间的延长略有增加。生谷物在储存初始日缺乏棕榈油酸(C_16:1)，但在25°C和45°C的储存期末产生了该物质，这可能是由于在较高储存温度下，氧依赖性去饱和酶将棕榈酸转化为棕榈油酸。生谷物中不饱和脂肪酸的总百分比最初较高(77.5%)，在45°C的储存温度下略有降低(77.41%)，发酵谷物也观察到类似趋势。这是因为不饱和脂肪酸由于存在高反应性的π键，在高温下高度 susceptible to thermo-oxidation（易发生热氧化）。

谷物脂肪酸谱的分类与判别

为了对珍珠粟谷物在不同储存温度下进行分类，采用了PCA、PLS-DA、sPLS-DA和oPLS-DA等监督和非监督技术。PCA揭示了数据总方差的73.1%，但在25°C和45°C下储存60天和120天的生谷物簇与发酵谷物簇存在重叠。PLS-DA模型解释了脂肪酸数据58.2%的方差，其R2值为93.72%，Q2值为50.0%，但同样存在簇重叠现象。变量重要性投影(VIP)图显示，硬脂酸(VIP得分最高，为2.90)、芥酸、亚油酸、油酸、顺式-11-二十碳烯酸和棕榈酸是对区分特征贡献最大的脂肪酸。高VIP得分表明不饱和脂肪酸的存在，这些是酸败的生物标志物。

相比之下，oPLS-DA和sPLS-DA能够根据不同储存条件清楚地区分脂肪酸数据。oPLS-DA的正交T得分1和2分别贡献了总方差的31.3%和19.1%。sPLS-DA构成了数据总方差的47.2%，显示出更好的区分能力，特别是将45°C下储存初始日的生谷物与120天后的样品区分开来，表明了脂肪酸组成的变化。sPLS-DA在数据拟合能力和计算效率方面的优势使其成为区分储存期间获得的脂肪酸数据的最佳方法。

使用聚类热图分析进行脂质分类

聚类热图分析证实了γ-亚麻酸(C_18:3n6)、丁酸(C_4:0)和反油酸(C_18:1n9t)在45°C下储存120天的生珍珠粟谷物中作为主要脂肪酸存在。而在类似储存条件下的发酵谷物中，则显示出顺式-11-二十碳烯酸(C_20:1)和顺式-10-十七碳烯酸(C_17:1)的积累是主要脂肪酸。γ-亚麻酸(0.02%)在45°C储存120天时的 dominance（优势）表明生谷物出现了酸败迹象。在25°C环境条件下储存60天时，表现出二十三烷酸(C_23:0)和顺式-11,14,17-二十碳三烯酸(C_20:3n3)作为主要脂肪酸。二十三烷酸作为主要脂肪酸的现象也出现在45°C下储存60天的生谷物和120天的发酵谷物中。神经酸(C_24:1)的优势在5°C下储存60天的生谷物中被报道，该化合物在其他储存期和温度下不存在。热图显示，无论储存条件如何，亚油酸(C_18:2n6c)和油酸(C_18:1n9c)作为生料和发酵谷物中的主要脂肪酸大量存在。较长的储存期和持续时间改变了这些酸在生料和发酵珍珠粟谷物中的浓度。

本研究表明，储存温度和周期显著影响生料和发酵珍珠粟谷物的脂肪酸谱。鉴定出的主要脂肪酸化合物包括亚油酸(C_18:2n6c)、油酸(C_18:1n9c)、棕榈酸(C_16:0)、硬脂酸(C_18:0)和α-亚麻酸(C_18:3n3)。较高的储存温度和较长的储存时间改变了这些酸在生料和发酵谷物中的浓度。与PLS-DA相比，oPLS-DA和sPLS-DA能够根据不同的储存条件清楚地对脂肪酸数据进行分类。具有高VIP得分的不饱和脂肪酸（如亚油酸、油酸和芥酸）是酸败的生物标志物。在特定时期进行脂肪酸分析有助于在适当的时候采取适用的补救措施，以避免谷物酸败或为珍珠粟推荐食用截止日期。同时，强烈建议在食品中利用珍珠粟组分，因为它是脂肪酸的良好来源。这项研究有助于开发以发酵为基础的珍珠粟谷物食品/功能性食品，这些食品具有改善的脂肪酸组成，从而提升营养价值。此外，它可以为 optimal storage methods（最佳储存方法）提供见解，以维持珍珠粟的营养 profile（概况），特别是在炎热潮湿的环境中。总的来说，这项工作能够通过脂肪酸标记物认证发酵和未发酵的珍珠粟，防止食品 adulteration（掺假）并确保产品完整性，从而提高珍珠粟产品的质量、储存性和健康益处。该研究发表于《Scientific Reports》期刊，为谷物储存科学和食品加工领域提供了重要的理论和实践价值。