无测序单分子分辨率全基因组空间转录组技术RAEFISH的开发与应用

本研究针对现有空间转录组技术在转录组覆盖度与空间分辨率间的权衡局限，开发了RAEFISH（Reverse-padlock Amplicon-encoding Fluorescence In Situ Hybridization）技术，实现了全基因组尺度（>20,000基因）单分子分辨率的空间转录组成像。该技术通过创新性探针设计与多重信号解码策略，成功应用于细胞系、小鼠肝脏、胎盘及淋巴结等多种组织，揭示了细胞周期相关基因表达模式、肝脏分区依赖性转录程序、胎盘细胞互作特征等生物学发现，并进一步拓展至CRISPR筛选中的gRNA直接空间检测，为生物医学研究提供了高分辨率、无偏见的空间转录组分析工具。

　　

在生物医学研究领域，理解基因表达的空间分布对于揭示细胞功能、组织发育及疾病机制至关重要。近年来，空间转录组技术的迅猛发展让科学家能够在组织原位观察基因活动，但现有技术仍存在明显局限：基于空间捕获/标记的方法（如Slide-seq）虽能覆盖全基因组，但空间分辨率仅达细胞群水平，无法解析单细胞及亚细胞结构；而基于成像的方法（如MERFISH、STARmap）虽具备单分子分辨率，却因技术限制仅能靶向数百至数千个预选基因，难以进行无偏见的全基因组探索。这一矛盾严重制约了在复杂组织中系统性发现空间转录组特征的能力。

为突破这一瓶颈，耶鲁大学Siyuan Wang团队在《Cell》杂志发表了题为“Sequencing-free whole-genome spatial transcriptomics at single-molecule resolution”的研究，开发了名为RAEFISH的全新空间转录组技术。该技术巧妙结合了滚环扩增（RCA）与多重荧光原位杂交（FISH）的优势，通过“反向挂锁探针”设计，实现了全转录组尺度（人类23,000基因、小鼠22,000基因）的单分子级空间成像，且无需预选基因或依赖测序。

关键技术方法简介

RAEFISH的核心创新在于探针设计：针对每个RNA靶标，设计一对相邻结合的线性引物探针和反向挂锁探针，后者通过连接酶环化后启动RCA扩增，生成包含特定编码序列的DNA扩增子；随后利用94位二进制编码探针库（94选4的汉明距离4编码方案）进行47轮多重FISH成像解码。该策略使探针库成本降低至传统方法的1/123（单次实验成本约18美元），并有效避免信号重叠。技术验证采用A549细胞系及小鼠肝脏、胎盘、淋巴结冰冻切片（样本来源为C57BL/6小鼠），同时整合CRISPR筛选库（靶向574个染色质相关基因）实现gRNA直接空间检测。

研究结果

RAEFISH在人类细胞中揭示细胞周期相关基因与RNA亚细胞定位

在A549肺癌细胞应用中，RAEFISH平均在每个细胞检测到3,749个RNA分子，覆盖1,287个基因，与RNA-seq数据相关性达0.66。通过分析细胞周期依赖性表达，鉴定出1,006个细胞周期相关基因（如G2/M期标志物CKS2、CENPF），其中包含99个长链非编码RNA（如NEAT1、MALAT1）。进一步通过DAPI染色区分核质区域，发现lncRNA整体核内比例高于蛋白编码基因，且特定lncRNA（如FIRRE）显示高度核定位，而H19等则偏向胞质分布。

小鼠肝脏空间转录组架构与分区依赖性表达

应用RAEFISH于小鼠肝脏组织，成功识别肝细胞、胆管细胞、白细胞等主要细胞类型，并明确区分门静脉周围（periportal）和中央静脉周围（pericentral）肝细胞。通过定义“分区评分”（反映细胞与门静脉区肝细胞的空间邻近度），发现非肝细胞（如胆管细胞、白细胞）亦存在分区依赖性基因表达：胆管细胞中39个分区标志基因（如Cyp1a2、Glul）富集于视黄醇代谢通路，提示其参与外周区解毒功能。尤为重要的是，细胞互作分析揭示胆管细胞与白细胞（以中性粒细胞为主）在门静脉区显著互作，且互作胆管细胞高表达MHC II类分子（如H2-Ab1），暗示其抗原呈递功能。

胎盘发育中的细胞互作与功能特化

在小鼠E13.5胎盘模型中，RAEFISH清晰勾勒出蜕膜区、交界区、迷路区的空间结构，并鉴定出蜕膜基质细胞（DSC）、血管内皮细胞（EC）、巨噬细胞等类型。互作分析显示DSC与血管EC、NK细胞显著关联。进一步比较蜕膜区巨噬细胞（与DSC互作）和迷路区霍夫鲍尔细胞（HBC），发现前者高表达MHC II类分子与A2m（抗炎因子），后者则上调血管生成相关基因（如Vegfa），体现了巨噬细胞在母胎界面免疫调节与血管发育中的双重角色。DSC与血管EC互作时上调Rarres2（趋化因子chemerin）及抗氧化基因（如Prdx5），可能介导NK细胞招募及氧化应激保护。

淋巴结微环境的空间转录组特征

在小鼠淋巴结应用中，RAEFISH明确区分皮质区B细胞与副皮质区T细胞，并可视化生发中心（GC）结构。通过分区评分分析，发现巨噬细胞中Siglec1（唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素1）在B细胞区富集，而Vsir（VISTA免疫检查点蛋白）在T细胞区高表达，提示不同区域巨噬细胞功能特化。基因本体（GO）分析显示B细胞区富集抗原呈递相关基因，T细胞区则富集T细胞受体重组相关通路。

Perturb-RAEFISH实现CRISPR筛选的gRNA直接空间读值

通过将RAEFISH应用于A549-CRISPR库（靶向574个基因），直接检测gRNA spacer序列，平均每个细胞检测41个gRNA分子，89.3%细胞可明确分配单一gRNA身份。同步MERFISH检测显示，靶基因敲除后其RNA表达显著下调。聚类分析鉴定出52个扰动基因簇（如簇6富集于染色体凝聚调控），揭示了染色质相关基因的功能网络。

结论与意义

RAEFISH技术首次实现了全基因组尺度与单分子分辨率的空间转录组分析，突破了现有技术只能在覆盖度与分辨率间权衡的困境。其在多种组织中的成功应用证实了：（1）能够无偏见发现细胞类型特异性及区域依赖性表达程序（如肝脏分区标记）；（2）揭示细胞互作微环境中的功能重编程（如胆管细胞抗原呈递）；（3）支持发育与免疫过程中的空间功能解析（如胎盘巨噬细胞特化）；（4）拓展至功能基因组学筛选，实现表型与遗传扰动的直接空间关联。该技术为发育生物学、肿瘤微环境、神经科学等领域提供了强大工具，有望推动空间多组学研究的范式变革。