人血浆中三种噁唑烷酮类抗菌药物同步定量LC-MS/MS方法的建立及其在治疗药物监测中的应用
《Drug Delivery》：LC-MS/MS Method for Simultaneous Quantification of Three Oxazolidinone Antimicrobials in Human Plasma: Application to Therapeutic Drug Monitoring
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时间：2025年10月02日
来源：Drug Delivery 8.1
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本综述建立并验证了一种可同时定量人血浆中利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺的LC-MS/MS方法，该方法符合ICH M10指南，具有高灵敏度（LLOQ：25.0–50.0 ng/mL）、宽线性范围（25.0–15,000.0 ng/mL）和良好稳定性，成功应用于临床TDM，为优化噁唑烷酮类药物治疗方案、避免毒性（如骨髓抑制）提供了关键工具。
噁唑烷酮类抗菌药物对多重耐药革兰阳性病原体有效，但由于患者药代动力学差异，其疗效和安全性面临挑战。本研究旨在建立一种液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于同时定量多种噁唑烷酮类抗菌药物，包括利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺，以应用于治疗药物监测（TDM）。
由于抗生素在临床中的长期广泛使用，抗菌素耐药性已成为一个主要的全球健康问题，导致抗感染治疗失败、住院时间延长和高死亡率。特别是多重耐药革兰阳性细菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）和耐万古霉素肠球菌（VRE），已被报道为重症监护室（ICU）中严重医院感染的主要原因。作为一种最近的对MRSA、MRSE和VRE等具有活性的合成抗菌药物，噁唑烷酮因其独特的抗菌机制——抑制蛋白质合成的初始阶段，且与其他药物无交叉耐药性，而受到广泛关注并显示出巨大前景。目前市场上有三种噁唑烷酮类抗菌药物：利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺。利奈唑胺是FDA于2000年批准的第一个噁唑烷酮，目前用于治疗社区获得性肺炎、医院获得性肺炎、复杂和非复杂皮肤及皮肤结构感染，以及由MRSA、VRE和结核引起的感染。特地唑胺是第二代噁唑烷酮药物，于2014年被FDA批准用于治疗急性细菌性皮肤和皮肤结构感染（ABSSSI）。康替唑胺是一种新型噁唑烷酮，于2021年被中国国家药品监督管理局（NMPA）批准用于复杂皮肤和软组织感染（cSSTIs）。
基于药效学和药代动力学特征，这三种噁唑烷酮表现出相似的抗菌谱和机制，但在临床应用上有所不同。一项荟萃分析表明，在MRSA相关肺炎中，利奈唑胺比特地唑胺更有效，而在ABSSSI中，特地唑胺与利奈唑胺效果相当，且不良反应发生率低于利奈唑胺。此外，临床研究表明，在治疗cSSTIs和分枝杆菌感染时，康替唑胺比利奈唑胺更有效，且骨髓抑制发生率更低。利奈唑胺由于其广泛的证据和广泛的适应症，仍然是首选的經驗性选择，但其半衰期短（4-5小时）需要每日两次给药，长期使用有骨髓抑制或神经毒性的风险；特地唑胺的半衰期较长（约12小时），允许每日一次给药，提高了门诊患者的依从性；康替唑胺表现出优化的代谢（非肾脏排泄）和较低的血液学毒性，有利于长期治疗或合并症患者。因此，在临床实践中，基于噁唑烷酮的方案是根据感染情况、患者状态和治疗持续时间动态调整的。
尽管机制明确，但噁唑烷酮抗生素在常规治疗期间的疗效取决于其全身暴露量，这主要由血浆浓度超过目标病原体最低抑菌浓度（MIC）的时间（T>MIC）和总浓度-时间曲线下面积（AUC）决定。利奈唑胺的药代动力学/药效学（PK/PD）目标是实现T>MIC≥85%和AUC/MIC>100。康替唑胺对MRSA表现出令人满意的疗效，游离药物AUC/MIC≥2.3的累积反应分数>90%。此外，超过噁唑烷酮的治疗安全剂量可能导致神经毒性、血液毒性和血小板减少等不良事件。这主要归因于患者间和患者内极大的药代动力学变异性，导致暴露不足或过量，从而造成治疗失败或药物积累，与毒性相关。因此，通过调整剂量提供个性化抗菌治疗以最大化治疗成功是必要的，这需要治疗药物监测（TDM）。
尽管噁唑烷酮的TDM不是强制性的，但大量研究表明，评估其有效性和安全性是必要的。以往的研究主要集中在分析生物基质中的单一噁唑烷酮抗生素。Tanaka等人开发了一种用于血浆中利奈唑胺和特地唑胺的UPLC-MS/MS方法，Zhang等人报道了一种用于血浆和脑脊液中康替唑胺的LC-MS/MS方法。然而，关于多种噁唑烷酮同时分析的综合研究很少。值得注意的是，有报道称利奈唑胺诱导的骨髓毒性可以通过转换为特地唑胺和康替唑胺来纠正，表明特地唑胺和康替唑胺由于其低血小板减少率而有潜力作为利奈唑胺的替代品。因此，量化生物基质中的单一噁唑烷酮限制了它们在治疗转换或联合治疗监测等场景中的效用。为了准确评估转换期间患者的药物浓度，并及时调整药物剂量以避免潜在风险，迫切需要一种能够同时定量多种噁唑烷酮抗菌药物的方法。
在本研究中，我们开发并验证了一种快速可靠的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于同时测定住院患者血浆中的利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺，该方法可应用于临床高通量检测，并为合理用药提供宝贵支持。
利奈唑胺（纯度：99.0%）购自麦克林生化科技有限公司（中国上海）。康替唑胺（纯度：99.92%）由盟科药业（中国上海）提供。特地唑胺（纯度：99.19%）和伏立康唑-d3（纯度：99.56%），一种同位素标记的内标（IS），购自MedChemExpress LLC（美国新泽西州蒙茅斯章克申）。HPLC级甲醇、乙腈（ACN）和水以及LC-MS级溶剂甲酸（FA）和醋酸铵（NH4OAc）购自赛默飞世尔科技（美国新泽西州费尔劳恩）。二甲基亚砜（DMSO；纯度 > 99.5%）购自北京莱伯生物技术有限公司（中国北京）。
Preparation of Calibration Standards (STDs) and Quality Control Samples (QCs)
利奈唑胺、特地唑胺、康替唑胺和伏立康唑-d3（各1000.0 μg/mL）的储备溶液用DMSO制备，并储存在-80 °C。不同浓度的工作溶液通过用含0.1% FA（v/v）的50% ACN（v/v）梯度稀释制备。一系列STDs在空白血浆中制备，浓度分别为50.0/25.0, 100.0/50.0, 250.0/125.0, 1000.0/500.0, 2500.0/1250.0, 5000.0/2500.0, 12,000.0/6000.0, 15,000.0/7500.0 ng/mL（利奈唑胺和康替唑胺/特地唑胺）。QC样品分别在低限、低、中和高浓度下制备：50.0/25.0, 150.0/75.0, 5000.0/2500.0, 10,000.0/5000.0 ng/mL。250.0 ng/mL的IS工作溶液用甲醇: ACN (1:1, v/v)制备，并储存在4 °C。
所有收集的血液样品在4 °C下以3500 rpm（约2123 g）离心5分钟以获得血浆。取50 μL STDs、QCs和血浆样品，加入200 μL IS溶液，并进行匀质化以沉淀蛋白质。样品在4 °C下以14000 rpm（约17968 g）离心10分钟。取100 μL样品与200 μL含0.1% FA（v/v）的50% ACN（v/v）混合，并转移到自动进样器小瓶中进行LC-MS/MS分析。
LC-MS/MS使用安捷伦1260高效液相色谱仪 coupled to a 6460A三重四极杆质谱仪（安捷伦科技，美国帕洛阿尔托）进行，配备安捷伦喷射流离子源和正模式电喷雾电离（ESI+）。色谱分离在安捷伦Eclipse Plus C18柱（100 × 2.1 mm, 3.5 μm）上进行，使用含0.1% FA的10 mM NH4OAc水溶液（流动相A）和含0.1% FA的5 mM NH4OAc的90% ACN溶液（流动相B），保持在室温。自动进样器进样体积为5 μL。以0.3 mL/min的流速进行梯度洗脱，B (%)程序如下：0.0–0.20 min, 15%; 0.20–1.50 min, 70%; 1.50–4.00 min, 98%; 4.00–6.00 min, 15%。
应用的质谱参数如下：毛细管电压，4000V；干燥气，350 °C, 5 L/min；鞘气，350 °C, 5 L/min；雾化器压力，30 psi。离子监测在多反应监测（MRM）模式下进行，参数见表1。
数据采集和分析使用安捷伦MassHunter工作站软件（版本B.08.00）进行。
本方法根据国际人用药品注册技术协调会（ICH）的《生物分析方法验证（M10）》在线性、选择性、准确度、精密度、基质效应、回收率、稳定性和残留方面进行了全面验证。
使用八个标准浓度（50.0/25.0, 100.0/50.0, 250.0/125.0, 1000.0/500.0, 2500.0/1250.0, 5000.0/2500.0, 12,000.0/6000.0, 15,000.0/7500.0 ng/mL（利奈唑胺和康替唑胺/特地唑胺）构建三种分析物的校准曲线。通过目标分析物与IS的峰面积比，使用1/X2加权因子进行线性回归来评估校准曲线的线性。在三个不同的日子里对利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺进行了三次线性评估。反算浓度的可接受标准为理论值的±15%（最低浓度为±20%）。
使用六个无药空白血浆样品评估测定的选择性和特异性。处理并分析了加标有利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺在定量下限（LLOQ）水平的空白样品以及仅加标IS的空白样品。当信号小于LLOQ的20%且小于IS响应的5%时，认为不存在干扰成分是可接受的。
使用四种QC样品（低限、低、中和高浓度）在三个不同的日子里分别对利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺进行六次重复测定，评估日内和日间准确度和精密度。QC样品每天新鲜制备，持续三天。准确度使用平均相对误差（MRE%）测量。精密度表示为相对标准偏差（RSD%）。偏差<15.0%（LLOQ<20.0%）。
为了测量基质效应，将20 μL三种浓度水平（LQC, MQC, HQC）的分析物混合标准溶液加入到180 μL血浆样品和溶剂溶液中。通过比较用加标溶液重建的血浆样品中分析物的峰面积与溶剂中分析物的峰面积（六次重复）来评估基质效应。
通过比较提取前加标的利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺的峰面积与相同浓度下提取后分析物的峰面积来评估回收率。本研究分析了使用来自六个不同来源的血浆制备的低、中和高QC浓度样品。平均回收率计算为每个单独QC浓度水平六次重复的平均值，而总回收率通过从其低、中和高QC浓度水平获得的平均回收率取平均来确定。
进行稳定性实验以评估三种分析物在各种条件下的稳定性。使用加标低和高QC浓度的血浆进行短期和长期稳定性测试。短期稳定性通过样品在室温下保持0, 8小时间隔进行评估。长期稳定性通过将样品在-80 °C储存40天进行测试。通过在4 °C下在自动进样器中放置30小时后重新分析来评估自动进样器稳定性。通过在-80 °C下三次冻融循环评估冻融稳定性。此外，还评估了分析物和IS储备溶液的稳定性。短期稳定性通过样品在室温下保持15.8小时间隔进行评估，长期稳定性在-80 °C下评估204天。偏差<15.0%被认为是稳定的。
通过在校准曲线的最高浓度后注入空白血浆样品来检查残留。分析物的残留应小于LLOQ峰面积的20%。
所提出的多分析物分析与安捷伦1260高效液相色谱仪 coupled to a 6460A三重四极杆质谱仪在正电离模式下，允许同时测定利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺。
优化了色谱和MS方案以获得用于临床的高通量分析方法。安捷伦Eclipse Plus C18柱表现出良好的峰形和分离效率。含有10 mM NH4OAc的水和5 mM NH4OAc的90% ACN的流动相产生了最高的信号强度。添加0.1% FA用于减少峰拖尾。选择了优化的质谱仪参数，如扫描时间（驻留时间）、碎片电压和碰撞能量，以获得最灵敏和稳定的离子转换（表1）。利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺的保留时间（RT）分别为2.79、2.95和3.01分钟（图1）。
该测定在50.0–15,000.0 ng/mL（利奈唑胺和康替唑胺）和25.0–7500.0 ng/mL（特地唑胺）的浓度范围内呈线性。在不同三天获得的平均校准曲线对所有三种分析物显示出良好的相关系数（R2 > 0.993），并且测量浓度的偏差在标称浓度的±15.0%以内（图2）。
Selectivity and Specificity
利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺以及相应IS在血浆样品中的色谱图如图2所示。在分析物保留时间处未观察到干扰。对于空白血浆样品，三种分析物的信号低于LLOQ的20%，从而确保了高选择性和特异性（图3）。
三种分析物在LLOQ、LQC、MQC和HQC水平的日内和日间准确度和精密度，分别表示为平均相对误差（MRE%）和相对标准偏差（RSD%），如表2所示。三种分析物的日内和日间准确度分别在93.8%-112.4%和96.9%-108.5%之间，而日内和日间精密度分别在0.5%-6.7%和1.2%-6.8%之间，在指南要求的15%限值内。
基质效应是提取程序准确性的指标。在正常血浆中，三种分析物在LQC、MQC和HQC的平均基质效应在0.96和1.02之间，变异系数（CV%）在1.4%到3.4%之间，在可接受范围内。在溶血和高脂血症中，分析物在LQC和HQC的基质效应在0.95和1.14之间，CV%在0.1%到3.6%之间（表3）。
所有三种分析物的回收率在94.4%到104.2%之间。计算值与添加的理论浓度相比的偏差在6.6%以内（表4）。
三种化合物在低和高QC水平的稳定性测定总结在表5中。三种分析物在室温下8小时和自动进样器中4 °C下30小时保持稳定。特地唑胺和康替唑胺在-80 °C下40天保持稳定，而利奈唑胺观察到降解。然后我们评估了利奈唑胺在-80 °C下34天的长期稳定性。当储存在-80 °C时，所有分析物在至少三次冻融循环中保持稳定。储备溶液的稳定性测定总结在表6中。三种分析物和IS在室温下15.8小时保持稳定，在-80 °C下204天保持稳定。
残留评估为零，因为在注入HQC样品后，在分析物保留时间内空白血浆的检测限以上没有信号。
经过验证的LC-MS/MS方法应用于住院患者血浆样品中利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺的TDM。大多数患者的量化药物浓度在验证范围内，除少数超过线性范围需要稀释的样品外。在此，我们展示了来自四名年龄在78-98岁患者的几个同时含有康替唑胺和利奈唑胺的样品，这是由于从利奈唑胺治疗转换为康替唑胺治疗。从疗效和安全性角度，利奈唑胺谷浓度的治疗范围推荐为2–8 μg/mL。如表7所示，患者3的利奈唑胺血浆浓度为15.720 μg/mL，96小时后降至0.820 μg/mL，仍未完全消除。患者4从利奈唑胺转换为康替唑胺后，初始利奈唑胺血浆浓度约为22 μg/mL，48小时后仍高于10 μg/mL，仍超过安全阈值。康替唑胺的剂量在超高龄患者（> 96岁：400 mg/q12 vs 78岁800 mg/q12）中减半。较高剂量的康替唑胺（800 mg/q12）与较高的谷浓度（11.764 μg/mL）相关，而超高龄患者（400 mg/q12h）表现出可变的谷浓度（0.580–9.161 μg/mL）和峰浓度（3.179–34.698 μg/mL）。
在本研究中，开发了一种新的LC-MS/MS方法，用于同时检测人血浆样品中的噁唑烷酮类抗菌药物，包括利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺。选择乙腈:甲醇（1:1）进行蛋白质沉淀作为样品制备程序，因为其相对于固相萃取和液液萃取具有明显优势——特别是其高效率，非常适合快速处理大规模样品。方法验证进一步证明，蛋白质沉淀方法实现了高回收率，并且未观察到显著的基质效应。该方法在常规使用中的实施进一步得到了少量血浆样品（50 μL）和短色谱时间（6分钟）的支持。因此，它非常适合在短时间内处理大量样品。在流动相中添加醋酸铵和0.1%甲酸改善了分析物响应。该方法具有优异的线性，利奈唑胺和康替唑胺的校准范围为50.0–15,000.0 ng/mL，特地唑胺为25.0–7500.0 ng/mL，相关系数（R2>0.993）。不同的线性范围归因于特地唑胺与利奈唑胺和康替唑胺相比推荐剂量和频率较低（200 mg/d vs 600 mg/12h）。与先前报道的检测利奈唑胺或特地唑胺的方法相比，我们的方法更灵敏，LLOQ更低（利奈唑胺50.0 ng/mL，特地唑胺25.0 ng/mL）。尽管证明了利奈唑胺在-80 °C下34天的稳定性，但在40天的评估中观察到降解。因此，含利奈唑胺的血浆样品应在采集后34天内（在-80 °C下）进行分析，以确保分析物完整性。在临床实践中，所有用于TDM的血浆样品均在采集后48小时内进行分析。
由于利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺的作用机制相似，三种药物的药代动力学不同。利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺分别经历不同的肝脏代谢途径，分别由微粒体介导的吗啉环氧化、磺基转移酶（SULTs）和黄素含单加氧酶-5（FMO5）介导。大约30%的利奈唑胺是原型，50%的代谢物通过尿液排泄，而特地唑胺主要通过肝脏随粪便排泄，大约76%的康替唑胺被代谢并通过尿路消除。利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺的消除半衰期分别为4–6小时、12小时和2–3小时，这影响了剂量和给药频率。值得注意的是，临床环境中噁唑烷酮的治疗持续时间存在限制。利奈唑胺和特地唑胺的推荐持续时间通常分别限制在28天和6天，因为延长治疗可能会增加血液学和神经毒性的风险。然而，在真实生活中，延长噁唑烷酮疗程在治疗严重或复杂感染（如耐药结核病）中并不罕见。鉴于三种噁唑烷酮的独特代谢和半衰期，治疗转换容易产生风险，如转换前药物残留积累和转换后药物浓度重叠，这是单分析物监测无法解决的。这种同步量化能够在转换期间跟踪转换前和转换后的药物动态，直接防止前药积累的毒性，并指导新药的精确剂量调整。因此，强烈建议需要延长治疗持续时间的患者进行TDM。
为了优化噁唑烷酮的个体化给药方案，我们将该方法应用于临床环境，通过测量我们医院入院患者的样品。患者分析显示，老年患者中利奈唑胺的消除显著延长（降至约1 μg/mL：96小时 vs 24小时），导致利奈唑胺积累浓度远超过安全阈值，即使在转换为康替唑胺后也是如此。尽管根据患者状态（年龄）调整了康替唑胺的剂量，但康替唑胺暴露的个体间变异性仍然显著（Ctrough: 0.580–9.161 μg/mL, Cpeak: 3.719–34.698 μg/mL，剂量为400 mg/q12），这可能归因于老年患者与年龄相关的进行性肝肾功能障碍。然而，Cattaneo等人揭示，近70%年龄>80岁的患者利奈唑胺谷浓度>8 μg/mL，不良反应风险增加。Wu等人表明，中度肝功能损害患者的康替唑胺最大浓度（Cmax）较低，达到Cmax的时间（Tmax）比健康对照组长。此外，由于特地唑胺主要通过肝脏消除，FDA不良事件报告系统发现特地唑胺的肝衰竭报告发生率高于利奈唑胺。因此，噁唑烷酮的同时测定可以作为一个不可或缺的工具，用于最大化抗菌疗效，同时最小化毒性，特别是在有药代动力学改变风险的人群中。
我们的研究成功地证明了该方法在一个小型老年患者队列中从利奈唑胺转换为康替唑胺的效用。值得注意的是，我们观察到该组中利奈唑胺消除显著延长和显著的药代动力学（PK）变异性，这与多中心研究的结果一致，该研究确定高龄、肾功能障碍和肝功能损害是PK不可预测性的关键驱动因素。这种一致性强调了TDM在这些高风险人群中的重要作用。能够用单一、快速的测定无缝测量先前药物（利奈唑胺）的下降浓度和新药（康替唑胺）的上升浓度是非常宝贵的。它可以防止转换期间抗菌覆盖的关键空白，并减轻叠加毒性的风险。这些发现突出了我们方法的直接临床价值；为了进一步扩展其在各种环境中精确TDM的适用性，未来在其他分层人群中的验证将是必不可少的。未来的工作将侧重于将该方法应用于老年和儿科患者以及其他特殊人群。基于积累的临床数据，将进行深入的群体药代动力学研究，以指导噁唑烷酮临床使用的精准医疗。
在本研究中，我们开发并验证了一种新的LC-MS/MS方法，用于同时定量人血浆中的三种噁唑烷酮（利奈唑胺、特地唑胺和康替唑胺）。优化后的方法展示了几个优点，包括简单、分析时间快、灵敏度高和特异性好。此外，TDM的成功应用揭示了其在优化抗菌治疗方面的临床效用。
Institutional Review Board Statement
本研究经中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准（批准号S2021-609-01），由于对匿名TDM数据的回顾性分析，放弃了知情同意的要求。所有患者数据均严格保密以确保隐私保护。
ABSSSI, 急性细菌性皮肤和皮肤结构感染; cSSTIs, 复杂性皮肤和软组织感染; FMO-5, 黄素含单加氧酶-5; ICH, 国际人用药品注册技术协调会; ICU, 重症监护室; LC-MS/MS, 液相色谱-串联质谱; IS, 内标; LLOQ, 定量下限; MRM, 多反应监测; MRSA, 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌; MRSE, 耐甲氧西林表皮葡萄球菌; NMPA, 中国国家药品监督管理局; PK, 药代动力学; QC, 质量控制; TDM, 治疗药物监测; VRE, 耐万古霉素肠球菌。
Na Zhang: 方法论, 验证, 形式分析, 调查; Nan Bai: 方法论, 验证, 形式分析, 调查; Ying Wang: 写作 - 初稿, 审阅与编辑, 可视化; Beibei Liang: 调查, 写作-审阅与编辑; Yun Cai: 概念化, 写作-审阅与编辑, 监督, 项目管理, 资金获取。所有作者对要发表的版本给予最终批准，并同意对工作的所有方面负责。
